密度梯度离心和免疫磁珠分选相结合分离脐血中胎儿有核红细胞

罗欣 杜颖颖 张进 马端，2*

（1.复旦大学上海医学院 分子医学教育部重点实验室，上海 200032；2.复旦大学生物医学研究院 出生缺陷研究中心，上海 200032）

产前诊断是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某些遗传病或先天畸形做出准确的诊断。目前采用的诊断方法多属于有创性检查，对妊娠妇女和胎儿都有一定的风险［1］。从妊娠妇女外周血中分离胎儿有核红细胞（fetal nucleated red blood cells，FNRBCs）进行基因分析已成为国内外无创性产前诊断的研究热点。但是母体循环中的FNRBCs数量稀少，难以达到临床检测的要求，高效富集FNRBCs方法已成为产前诊断中筛查染色体异常和基因异常的必要手段。本研究通过结合密度梯度离心和免疫磁珠分选的方法提高分选后FNRBCs的纯度。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2007年5月至2008年3月在复旦大学附属妇产科医院足月分娩的健康胎儿脐血5例，每例6ml，EDTA抗凝。

1.2 实验方法

1.2.1 密度梯度离心 用Ficoll（美国Sigma公司）制备密度1.119／1.107／1.077的三重梯度，每个梯度2ml，依次加入15ml离心管中。将血标本：0.1MPBS=2：3（V／V）进行稀释，稀释后的血标本缓置于6ml密度梯度液上，室温22℃，400g×40min。在1.077和1.107密度界面上，可见呈白膜状的细胞层面。此层面即为富含单个核细胞，用枪头轻轻插到此层，将细胞转移入50ml管中，加入30ml PBS／1%BSA，300g×10min，弃上清，细胞沉淀再用相同的方法洗2次以去除残留的密度梯度液，最后细胞沉淀重悬于300ul PBS／0.1%BSA中，吹匀。

1.2.2 细胞计数 取2ul重悬液加入198ul PBS中（即稀释100倍），光镜下计数4大格细胞数，重复1遍。8大格细胞数×100（稀释倍数）×104=细胞数／ml。取106个细胞，用 PBS／0.1%BSA 补足80ul。

1.2.3 免疫磁珠分选 加入20ul CD71抗体磁珠（德国美天旎公司）4℃ 放置15min。300g×10min，弃上清，加入1ml PBS／0.1%BSA，重悬沉淀后，300g×10min，弃上清，沉淀重悬于500ul PBS／0.1%BSA。组装美天旎磁珠分选系统。以500ul PBS／0.1%BSA润洗美天旎分选柱，待流空后，将分选的细胞上柱，收集流出液，标记为阴性细胞。取500ul PBS／0.1%BSA润洗管子，待流空后再重复2次，最后。取500ul PBS／EDTA／BSA加入分选柱，待流空后再重复一次。最后取1ml PBS／0.1%BSA加入分选柱，拿离磁场，冲洗入15ml管内，标记为阳性细胞。

1.2.4 免疫荧光染色 分选前细胞、分选后的阴性细胞、阳性细胞按1×105个细胞加入PE标记的CD45单克隆抗体（德国美天旎公司）和FITC标记的CD71单克隆抗体（德国美天旎公司）20μl，室温避光孵育30min，PBS洗3遍，1%多聚甲醛固定。流式细胞仪检测。

1.2.5 涂片Wright's-Giemsa染色 同时取分选前细胞、密度梯度离心后细胞和分选后阳性细胞进行细胞涂片，涂片后先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖。稍等片刻待染液干后加吉姆萨染液1～2滴，用枪头引导染色覆盖涂膜面。等1～2min，再将PBS（PH6.4）一滴一滴地加到涂片膜上，直至膜面上染色液形成把表面张力而终止染色液进入（PBS的用量为瑞氏吉姆萨染液之和的两倍）。染色10min，分色，用自来水冲洗至颜色明显变淡（3min），镜下观察。

2 结果

2.1 CD71分选结果 通过流式细胞仪检测发现CD71单克隆抗体磁珠用于脐血中胎儿有核红细胞分选（CD71+，CD45-），分选后的纯度可以达到81%，而分选前CD71阳性细胞只占23.2%（图1）。

BLANK001：无标记的细胞，QIAN002：分选前细胞CD71和CD45双标记，HOU+004：分选后阳性细胞CD71和CD45双标记，HOU-003：分选后阴性细胞CD71和CD45双标记。

2.2 形态学观察

2.2.1 分选前脐血涂片可见大量的成熟红细胞，有核细胞以淋巴细胞、粒细胞和单核细胞为主，含少量有核红细胞（图2）。

2.2.2 三重密度梯度离心后取单个核细胞层，可见绝大多数细胞为单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞和有核红细胞），含少量红细胞（图3）

图1 CD71磁珠分选的结果

图2 分选前的脐血涂片瑞式吉姆萨染色（×400）

图3 三重密度梯度离心后细胞涂片瑞式吉姆萨染色（×400）

2.2.3 CD71单克隆抗体磁珠分选后阳性细胞多为胞浆丰富略嗜碱性的有核红细胞（图4、图5）。

图4 分选后阳性细胞瑞式吉姆萨染色（×400）

图5 分选后阳性细胞瑞式吉姆萨染色（×1000）

3 讨论

早在1893年Schmorl［2］首先提出孕妇外周血中存在胎儿细胞，该观点今年已经被一些研究证实［3］。这就为非侵入性产前诊断提供了很好的理论依据。Lo等［4］研究表明母血中胎儿细胞数量随孕周的增加而增加，且存在于整个孕期，使其成为很好的诊断材料。但是应用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断已发展近20年，仍然因为技术和价格的局限性不能广泛在临床中使用，因此高效富集母血中的FNRBCs已经成为开展无创性产前诊断的关键。FNRBC是单核细胞，含有胎儿全部的遗传物质。它在孕妇外周血中的生存期比较短［5］，并且有区别于其他细胞的多种筛选标记，如转铁蛋白受体（CD71）、血栓敏感素受体（CD36）等。目前用于分选FNRBCs的方法主要有：密度梯度离心（DGC）、流式细胞计数分选法（FACS）、显微操作发、免疫磁珠分离法、选择性红细胞裂解、凝集素富集法等。但是这些方法存在成本高或特异性不强等因素。虽然Bianchi等［6］研究表明FACS是迄今为止最佳分选富集胎儿细胞的方法，但FACS的缺点是设备昂贵、操作步骤较复杂、可影响细胞的形态。本试验采用密度梯度离心和免疫磁珠分选相结合的方法，既可以排除密度梯度离心法获得细胞数量少，纯度不高且容易造成丢失的缺点［7］，又可以减少因为CD71在母体淋巴细胞、成熟红细胞、网织红细胞、血小板表面也有一定程度表达造成的污染［8］。经过对分选前后细胞进行流式细胞分析技术和染色，此方法可以对脐血中FNRBCs进行很好的分选，并达到比较理想的分选纯度（81%）。优化后的实验方法可以运用于分选孕妇外周血中的FNRBCs。

［1］Firth HV，Boyd PA ，Chamberlain PF ，et al.Analysis of limb reduction defect s in babies exposed to chorionic villus sampling［J］.Lancet，1994，8905：1069-1071.

［2］Schmorl G.Uberdas Schicksal embolisch verschleppter［J］.Placentarzellen Zentrabl Gynakol，1950，29：129.

［3］Simpson J L，Elias S.Isolating fetal cells from maternal blood：advances in prenatal diagnosis through molecular technology［J］.JAMA，1994，210：2357-2361.

［4］Lo YMD，Tein MSC，Lau TK，et al.Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum：implications for noninvasive prenatal diagnosis［J］.Am J Hum Genet，1998，4：768-775.

［5］Gussin，HeleneA，Elischal，et al.Culture of fetal cells from maternal blood for prenatal diagnosis［J］.Oxford University Press，2002，6：523-527.

［6］Bianchi DW，Flint AF，Pizzimenti MF，et al.Isolation of fetal DNA from nucleared erythrocyte in maternal blood［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：3279-3283.

［7］Zhong XY，Hahn S，Steinborn A，et al.Quantitative analysis of intact fetal cells in maternal plasma by real2time PCR［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2006，1：20-24.

［8］陈汉平，贺桂芳.孕妇外周血中胎儿细胞及胎儿DNA的检测［J］.中国实用妇科与产科杂志，2002，10：596-598.