复元醒脑汤对高血压性脑出血大鼠血-脑屏障通透性的干预作用

方邦江 周 爽 陈宝瑾 黄金阳 耿 赟 季学清 郭 全 王 宏上海中医药大学附属龙华医院（200032）

复元醒脑汤对高血压性脑出血大鼠血-脑屏障通透性的干预作用

方邦江 周 爽 陈宝瑾 黄金阳 耿 赟 季学清 郭 全 王 宏
上海中医药大学附属龙华医院（200032）

目的 探讨复元醒脑汤对高血压性脑出血大鼠脑水肿及血-脑屏障通透性的干预作用。方法 将SHR大鼠随机分为四组，分别为假手术组、模型组、安宫牛黄胶囊组、复元醒脑汤组，并与WKY大鼠假手术组对照,每组20只大鼠。模型组、安宫牛黄胶囊组和复元醒脑汤组在收缩压达到21.3KPa基础上以胶原酶加肝素尾状核注射法诱发脑出血，建立高血压性脑出血模型，其中安宫牛黄胶囊组和复元醒脑汤组分别给予相应药物干预，于造模后连续灌胃3天。两假手术组脑内注射及灌胃均为生理盐水，模型组灌胃为生理盐水。观测各组动物神经缺损行为体征、脑组织含水量、血-脑屏障通透性变化。结果 SHR模型组与WKY假手术组、SHR假手术组比较，神经缺损行为体征评分升高（均P＜0.01），脑组织含水量增加（均P＜0.01），脑组织中伊文思蓝含量亦增加（均P＜0.01）；SHR复元醒脑汤和SHR安宫牛黄胶囊两治疗组分别与SHR模型组比较，神经缺损行为体征评分降低（均P＜0.01），脑组织含水量减少（均P＜0.01），脑组织中伊文思蓝含量亦降低（均P＜0.01）；上述指标变化复元醒脑汤组与安宫牛黄胶囊组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论 复元醒脑汤可降低血-脑屏障通透性，减轻脑水肿程度，改善神经功能缺损，达到治疗高血压性脑出血的目的。

脑出血；脑水肿；自发性高血压大鼠；血-脑屏障

脑出血（Cerebral Hemorrhage，CH）是指原发性脑实质的非创伤性出血，是临床常见的脑血管疾病，主要病因是高血压。高血压伴发脑内小动脉病变，当血压骤升时破裂出血，称为高血压性脑出血。脑出血后引起机体和脑组织局部发生系列病理生理学反应，在血肿周围脑组织形成水肿带，继而引起神经细胞及其轴突的变性和坏死。脑出血后脑水肿的预防和治疗为临床实践中重要一环，在降低患者死亡率和致残率、改善患者生活质量方面起重要作用。临床应用复元醒脑汤治疗脑出血取得显著临床效果，为了进一步探讨复元醒脑汤治疗脑出血的作用机理，本实验拟在建立高血压性脑出血大鼠模型基础上，观测复元醒脑汤对其神经功能缺损、脑组织含水量、血-脑屏障(Blood-brain Barrier,BBB)通透性的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SHR大鼠80只，雄性，体重（320±20）g；SPF级京都Wista（Wistar Kyoto，WKY）大鼠20只，雄性，体重（320±20）g。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证：SCXK(沪)2007-005，饲养于上海中医药大学附属龙华医院科技楼实验动物中心。

1.2 主要试剂和仪器 胶原酶Ⅶ、伊文思、蓝甲酰胺（Sigma-Aldrich Inc，USA)；肝素（常州千红生化制药股份有限公司)；RBP-1型大鼠尾压心率测定仪（北京中日友好医院临床医学研究所）；ZH-蓝星B型脑立体定位仪（淮北正华生物仪器设备有限公司）；微量进样器（上海安亭微量进样器厂）；FA2004B电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；恒宇电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；电热恒温水箱（上海跃进医疗器械厂）；紫外可见分光光度计[UNICO(上海)仪器有限公司]。

1.3 实验药物 复元醒脑汤（人参9g单煎、三七15g，胆南星15g，大黄9g后下等），由本院制剂室生产提供，浓度为1200g生药／L；安宫牛黄胶囊由河北安国药业集团有限公司生产，0.4g/粒，批号：066401。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 购得动物后，适应性喂养1周，运用大鼠心率血压计测定大鼠尾动脉收缩压，SHR大鼠血压达到21.3KPa以上后，统一称重，按林氏[1]方法应用SPSS11.5软件包将SHR大鼠随机分为SHR假手术组（SHRS）、SHR模型组(SHRM)、SHR安宫牛黄胶囊组（SHRTa）、SHR复元醒脑汤组（SHRTf）；WKY大鼠为假手术对照组（WKYS）,每组大鼠20只。

1.4.2 脑出血模型建立 以任氏[2]胶原酶加肝素联合尾状核注射诱导的方法建立脑出血动物模型。造模前1日，各组大鼠禁食。大鼠经10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔麻醉。头顶备皮后俯卧位固定于ZH-蓝星B型脑立体定位仪上，正中矢状切开头皮，剥离骨膜，调节门齿托的高度，使动物的前、后囟处于同一水平。头皮下正中切口约0.8cm，于颅骨背侧前囟后0.2mm、中线旁2.9mm处钻孔，用固定于立体定位仪上的微量进样器沿钻孔进针，深约6mm (此处为尾状核位置)，注射含有0.5U/μl胶原酶Ⅶ和7U/μl肝素的生理盐水1μl，缓慢退针，钻孔处填入明胶海绵，缝合皮肤。WKY假手术组与SHR假手术组除注入尾壳核的液体为生理盐水外，其余步骤同模型组。

1.4.3 药物干预 SHR复元醒脑汤组于造模成功后，每日按生药4.22g/kg体重/d给予复元醒脑汤灌胃，每日1次，连续3天；SHR安宫牛黄胶囊对照组于造模成功后，每日按169mg/kg体重/d给予安宫牛黄胶囊灌胃，每日1次，连续3天。WKY假手术组、SHR假手术组、SHR模型组于造模成功后每日灌胃生理盐水1ml，每日1次，连续3天。

1.5 检测项目与方法

1.5.1 血压测定 大鼠适应性喂养1周后，运用RBP-1型大鼠心率血压计，在大鼠清醒状态下经尾动脉测定收缩压，每只大鼠测3次，取平均值。

1.5.2 神经缺损行为体征观察 造模后3天，各组大鼠采用Bederson[3]神经体缺损行为体征评分法进行评分。

轻抓鼠尾，提起高于地面1m，正常大鼠前爪伸直。

0 级（0 分）：无神经功能缺损

I级（1 分）：血肿对侧前肢回收屈曲于腹下，同侧前肢向地面伸展

II级（2 分）：I级体征+俯卧于桌面时从血肿侧向对侧推大鼠时阻力降低

III级（3 分）：I级体征+II级体征+大鼠行走时向血肿对侧肢体旋转(呈追尾状)

1.5.3 脑组织含水量测定 脑组织含水量(Brain Water Content,BWC)采用干湿脑重法测定。造模后3天，每组各取6只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后处死，迅速开颅取脑，取血肿周围脑组织（WKY假手术组和SHR假手术组取相应部位脑组织），电子天平先称取湿重，放入电热恒温鼓风干燥箱100℃烘烤24h，再称取干重，计算脑组织含水量：

1.5.4 伊文思蓝含量测定 造模后3天，每组各取6只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，分离股静脉，注入2%伊文思蓝（Evans Blue，EB，20mg/kg）循环2h后，迅速开胸暴露心脏，灌注针头从左心室插至主动脉根部，在右心耳处剪开作为出口，快速灌注生理盐水总量约250ml，至右心耳流出液体无血色后，迅速开颅取脑。取血肿周围脑组织（SHR假手术组和WKY假手术组取相应部位脑组织），称重后加入3ml甲酰胺，54℃恒温水浴箱中孵育48h，离心15min，取上清液在紫外分光光度计（λ=632nm）下测定光密度（Optical Density,OD）值。脑组织EB含量以OD/g湿脑组织表示，用EB含量(OD/g)代表脑血管通透性。

1.6 统计学分析 应用SPSS11.5统计软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以表示，组间均数比较采用方差分析；等级资料采用Ridit分析[4]。检验效能以P＜0.05为差异具有显著性，P＜0.01为差异具有非常显著性。

2 结果

2.1 神经缺损行为体征评分 由表1可见各组大鼠神经缺损行为体征评分情况：SHR假手术组与WKY假手术组比较差异无显著意义（P＞0.05）；SHR模型组、SHR安宫牛黄胶囊组和SHR复元醒脑汤组与WKY假手术组、SHR假手术组比较均具有非常显著差异（P＜0.01）。SHR安宫牛黄胶囊组、SHR复元醒脑汤组与SHR模型组比较均具有显著差异（P＜0.01）；SHR安宫牛黄胶囊组与SHR复元醒脑汤组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠神经缺损行为体征评分

2.2 脑组织含水量 由表2可见，各组大鼠脑组织含水量情况：SHR假手术组与WKY假手术组比较差异不具有统计学意义（P＞0.05）；SHR模型组、SHR安宫牛黄胶囊组和SHR复元醒脑汤组与WKY假手术组、SHR假手术组比较具有非常显著差异（P＜0.01）；SHR安宫牛黄胶囊组和SHR复元醒脑汤组与SHR模型组比较均具有非常显著差异（P＜0.01）；SHR复元醒脑汤组与SHR安宫牛黄胶囊组比较无显著差异（P＞0.05）。

2.3 血-脑屏障通透性 由表2可见各组大鼠伊文思蓝含量情况：WKY假手术组与SHR假手术组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。SHR模型组、SHR安宫牛黄胶囊组和SHR复元醒脑汤组与WKY假手术组、SHR假手术组比较均具有非常显著差异(P＜0.01)；SHR安宫牛黄胶囊组与SHR模型组比较具有非常显著性差异(P＜0.01)；SHR复元醒脑汤组与SHR模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)；SHR复元醒脑汤组与SHR安宫牛黄胶囊组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组大鼠脑组织含水量与伊文思蓝含量

表2 各组大鼠脑组织含水量与伊文思蓝含量

注：与WKYS比较，▲▲P＜0.01；与SHRS比较，◆◆P＜0.01；与SHRM比较，★★P＜0.01

组别 例数 脑组织含水量（%） 伊文思蓝含量（OD/g）WKYS 6 77.21±0.75 0.3484±0.0998 SHRS 6 77.84±0.53 0.3892±0.0959 SHRM 6 83.07±0.95 ▲▲◆◆ 1.0601±0.3399 ▲▲◆◆SHRTa 6 79.50±0.62 ▲▲◆◆★★ 0.9865±0.3025 ▲▲◆◆★★SHRTf 6 79.31±0.72 ▲▲◆◆★★ 0.8904±0.1678 ▲▲◆◆★

3 讨论

脑出血后引起机体和脑组织局部发生系列病理生理学反应，在血肿周围脑组织形成水肿带，继而引起神经细胞及其轴突的变性和坏死。脑水肿可引起颅内容物的容积增加，当超过颅腔所能容纳的程度时，可引起头痛、呕吐、眼底视乳头水肿、意识障碍、血压升高及反应性脉搏变慢和脑疝形成。此时若不及时采取干预措施，颅内压继续升高，可发展至脑组织灌注压降低，致使脑缺氧造成脑组织损害和血管扩张，继而引起血管运动麻痹，加重脑水肿，引起昏迷及并发症，后果严重，可导致死亡。

对脑出血后脑水肿研究发现，血-脑屏障破坏在不同因素引起的脑水肿形成过程中均发挥重要作用[5]。透射电镜观察手术切除脑出血血肿周围脑组织发现[6]，毛细血管内皮细胞肿胀，血-脑屏障破坏明显，小血管内外血液成分基本一致，血管外广泛出血，血管周围见“空泡样”变。微血管壁厚薄不一，内膜下层不完整，内皮细胞间紧密连接受损。进一步研究表明血-脑屏障的损伤与出血时间长短正相关，与水肿程度正相关[7]。

脑出血，属中医“中风”的范畴。中医学有关中风的记载，始见于《内经》。唐宋以前，诸家皆从内虚邪中之说；金元以降，火、虚、痰等论始发其端；及至明清，内伤积损、气虚血瘀、肝阳化风、血气上逆等说愈发丰富。其病因多认为与风、火、痰、虚、瘀密切相关。我们在长期临床过程中发现，中风大多为中老年人，正气亏虚为中风的基础。《杂病源流犀烛·中风源流》云：“人至五六十岁，气血就衰，乃有中风之病”。《景岳全书·非风》云：“卒倒多由昏愦，本皆内伤积损颓败而然”。气虚则痰瘀内生，痰、瘀分别是津、血的病理产物，一旦生成，又成为新的病理过程启动之因。痰是水液代谢障碍形成的病理产物，痰的生成同脾肾功能密切相关。肾者主水，肾气不足则水液蒸腾气化无力，聚而为痰；脾主运化，脾不健运则水湿不化，痰浊内生。“气为血之帅”，气虚无力推动血液运行而为瘀血。痰、瘀又可相互促生，胶着为患。痰瘀内阻，郁而化热，热极生风；或阴血亏虚，水不涵木，肝阳化风，风火相煽，发为中风。针对中风“正气亏虚、痰瘀互结、风火相煽”病机，采取复元醒脑为主，佐以逐瘀化痰、泄热息风等促进醒脑开窍之法，自拟复元醒脑汤治疗脑出血取得良好临床疗效。本方人参、三七、大黄、胆南星等药共用。人参大补元气，补脾益肺，脾气健运，肺气宣畅，则痰浊自消，气为血帅，气盛血行，瘀血自消，可达扶正祛邪之目的，为治本之药；三七止血不留瘀，针对出血性中风止血，并且可以达到化瘀目的；大黄通腑泻下，清热解毒，兼具活血化瘀之功，与三七合用一通一涩，止血不留瘀；胆南星清热化痰，息风定惊。诸药合用，方小力专，起“复元醒脑、逐瘀化痰、泄热熄风”之功。

本实验结果证实模型组大鼠神经缺损行为显著恶化，脑组织含水量显著增加，表明脑出血后脑水肿在病情进行性加重过程中发挥重要作用，脑水肿程度越重病情越凶险。安宫牛黄丸为临床治疗脑出血急性期常用中成药，相关研究表明安宫牛黄丸可以显著减轻脑出血后脑水肿程度及神经缺损行为[8,9]。复元醒脑汤可以降低高血压性脑出血大鼠脑组织含水量，进而改善神经缺损行为。复元醒脑汤对高血压性脑出血的治疗作用体现在减轻脑水肿，进而改善神经缺损行为，并且其对脑水肿程度及神经缺损行为改善具有和安宫牛黄胶囊等同的效果。

高血压性脑出血大鼠血-脑屏障通透性增加，表明高血压性脑出血后脑水肿产生与血-脑屏障通透性增加密切相关，血-脑屏障通透性增加为脑水肿产生的必要中间环节，各种因素导致血-脑屏障通透性增加，进而产生脑水肿。复元醒脑汤可以降低血-脑屏障通透性，表明复元醒脑汤对脑水肿的治疗作用体现在降低血-脑屏障通透性这一有效中间环节，减轻脑水肿程度，达到治疗高血压性脑出血的效果。

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The experimental study of Fuyuan Xingnao Decoction on blood-brain barrier permeability in hypertensive cerebral hemorrhage rats

LIN Mei,FANG Bang-Jiang,ZHOU Shuang,CHEN Bao-Jin2,HUANG Jin-Yang,GENG Yun,JI Xue-Qing,GUO Quan,WANG Hong
Department of Chinese Medicine,Central Hospital of Xuhui District,Shanghai 200031,China

Objective To study the effect of Fuyuan Xingnao Decoction on Blood-brain Barrier Permeability in Hypertensive Cerebral Hemorrhage Rats.Methods Spontaneously Hypertensive Rats were randomly divided into four groups,sham operation group(SHRS,N=20), model group(SHRM,N=20),Angong Niuhuang capsule group(SHRTa,N=20),and Fuyuan Xingnao Decoction group(SHRTf,N=20),compared with Wistar Kyoto rats sham operation group(WKYS,N=20).After the systolic pressure stabilizing in 21.3KPa,SHRM,SHRTa and SHRTf were induced cerebral hemorrhage by caudate nucleus injection with collagenase and heparin.Then SHRTa and SHRTf were given corresponding drugs in intragastric administration for three days after getting into cerebral hemorrhage,while SHRS and WKYS were all given intracerebral injection and intragastric administration with physiological saline,and SHRM was given intragastric administration with physiological saline.Rats of all groups were observed respectively their behavior and physical signs of neurologic defect,brain tissue moisture capacity,blood-brain barrier permeability.Results Compared with WKYS group and SHRS group,the SHRM group behavior and physical signs of neurologic defect grades,brain tissue moisture capacity and evans blue(EB) contents all increased up（P＜0.01）；SHRTa group and SHRTf group compared to SHRM group,behavior and physical signs of neurologic defect grades,brain tissue moisture capacity and EB contents all lowered（P＜0.01）；there is no statistical significant difference between SHRTa group and SHRTf group on the index changes（P＞0.05）.Conclusion Fuyuan Xingnao Decoction may achieve the purpose of treating hypertensive cerebral hemorrhage through lowing blood brain barrier permeability,relieve cerebral edema,and improve neurologic impairment.

Cerebral hemorrhage；Cerebral edema；Spontaneously hypertensive rats；Blood-brain barrier

10.3969/j.issn.1672-2779.2010.17.142

1672-2779（2010）-17-0206-03

2010-0）