前列腺干细胞抗原特异性MR分子探针体外成像实验研究

任 静，杨 勇，王 芳，魏光全，葛雅丽，常英娟，杨安钢，宦 怡*

近年来前列腺癌(prostatic cancer, PCa)在我国发病率逐年上升[1]，分子影像学(molecular imaging)的发展为PCa诊断及治疗开辟了新的领域[2]。前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)是PCa的肿瘤标志物之一[3]；纳米金磁微粒是一种具有Fe3O4/Au核/壳结构的纳米微粒，它既具有超顺磁性又具备胶体金的特点，可以通过简便的方法偶联微量抗体[4]。本实验室首次以金磁微粒作为MR对比剂标记抗人PSCA单抗7F5，构建了PCa特异性MR分子探针7F5@GoldMag，本文拟重点探讨该特异性分子探针在体外MR成像检测前列腺癌细胞的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞：前列腺癌PC-3细胞株由第四军医大学西京医院泌尿外科提供，对照组人肝癌细胞株SMMC-7721由本实验室保存。

主要试剂：实验组PSCA特异性分子探针7F5@GoldMag及对照组小鼠抗人非特异性抗体IgG@GoldMag均由本实验室制备并保存；RPMI 1640培养液(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)、二甲基亚砜(DMSO)和胰蛋白酶(Sigma公司，USA)，GoldMagTM-CS纳米金磁微粒抗体固定化试剂盒(陕西西大北美基因股份有限公司)。

主要设备：SHEL-LAB CO2孵箱(美国Shelton机械制造公司)、磁共振成像系统(Siemens Magnetom trio#tim 3.0T，德国)。

1.2 实验方法

细胞培养：在37℃、5%CO2浓度条件孵箱中培养，每两天更换培养液。待细胞长至80%时，显微镜下观察细胞生长良好，倒去培养液，0.1% PBS液清洗一遍，加入0.1%胰蛋白酶约3 ml，显微镜下观察细胞皱缩变圆后加入4 ml新鲜培养液，吹打均匀，吸出移入离心管，800rpm离心5 min，弃上清，加入新鲜培养液吹打至悬浮，1∶3传代，标记后放恒温培养箱中培养。

GoldMagTM-CS纳米金磁微粒用于MR成像的可行性：将金磁微粒原液(5mg/mL)100μL以1%琼脂糖凝胶倍比稀释(1∶40～1∶1280)混匀后置入1.5 ml离心管，标记，放置于4℃环境下至凝胶凝固；另取PBS分别加入1.5 ml离心管，放入特制试管架，MR成像。扫描参数： T2WI：TR 4000ms/TE 90ms，层厚2 mm，FOV 120mm。

7F5@GoldMag体外标记前列腺癌细胞：PC-3和SMMC-7721细胞分别与7F5@GoldMag、无关抗体@GoldMag交叉配对；将两种细胞分别接种于100mm培养皿，细胞铺满皿底约80%时弃去培养液，PBS漂洗3次；7F5@GoldMag及无关抗体@GoldMag(金磁微粒1 mg/ml，抗体浓度约60μg/ml)各取 2 ml，加入相应PC-3和SMMC-7721培养皿内；同时加入50μL羊血清；37℃孵育1 h；PBS漂洗5 min×3次；细胞刮刀刮取细胞，PBS冲洗后收集细胞，800rpm离心6 min；按实验分组将细胞团块与1%琼脂糖凝胶混匀注入1.5 ml离心管，分组标记(a: PC-3＋7F5@GoldMag；b: PC-3＋无关抗体@GoldMag；c: SMMC-7721＋7F5@GoldMag；d:SMMC-7721＋无关抗体@GoldMag)，4℃放置至凝胶凝固。

MR体外成像：在分别装有以上四组细胞凝胶的1.5 ml离心管分别加入PBS，置于充满PBS的4 ml试管内，放入特制试管架，行MR轴位及冠状位成像，扫描参数：T2WI：TR 4000ms/TE 90ms，层厚2 mm，FOV 120mm。

1.3 统计学方法

对所得图像测定信号强度，每个感兴趣区包括40(5×8)个像素，采用SPSS 11.5统计软件包，各组间信号差异比较用单因素方差分析，P＜0.05认为结果有统计学意义。

2 结果

2.1 GoldMagTM-CS纳米金磁微粒用于MR成像的结果

图1 不同浓度GoldMagTM-CS纳米金磁微粒T2WI图像Fig.1 T2WI of GoldMagTM-CS nanoparticles in different saturation

图2 不同浓度金磁微粒T2WI信号强度箱图比较Fig.2 Boxplot showed comparisons of T2WI signal intensity of GoldMagTM-CS nanoparticles in different saturation

不同浓度GoldMagTM-CS纳米金磁微T2WI 序列MR成像结果见图1，其信号差异比较统计学结果见图2，GoldMagTM-CS稀释至1∶640与1%琼脂糖凝胶相比，T2WI序列信号强度差异有统计学意义(P=0.000)。

2.2 7F5@GoldMag作用于前列腺癌细胞体外MR成像结果

7F5@GoldMag标记PC-3细胞(管a)T2WI信号强度明显降低，标记的SMMC-7721细胞(管c)信号强度无降低；而无关抗体@GoldMag标记的两种细胞(管b、d)信号强度均无降低(见图3)。

图3 T2WI各试管轴位及冠状位扫描，各试管依次为a:PC-3＋7F5@GoldMag，b: PC-3＋无关抗体@GoldMag，c: SMMC-7721＋7F5@GoldMag，d: SMMC-7721＋无关抗体@GoldMag。管a信号强度明显降低Fig.3 T2WI of the tubes (a: PC-3 +7F5@GoldMag,b: PC-3 + non-related IgG @GoldMag, c: SMMC-7721 + 7F5@GoldMag, d: SMMC-7721 + non-related IgG@GoldMag), T2 signal intensity of tube a showed signi fi cantly decrease.

2.3 各组细胞MR信号强度差异的统计学分析

管a、b之间信号差异有统计学意义(P=0.000)；管b、c、d之间信号差异无统计学意义(P=0.618)(见图4)。

3 讨论

3.1 MR分子影像探针构建策略

分子影像探针是指对某一特定生物分子(如蛋白质、DNA、RNA)具有特异性、靶向性并能够进行体内和/或体外示踪的标记化合物分子，它能够在体和/或离体反映靶生物分子的量和/或功能。目前，MR分子成像以其高分辨率及成像参数的多元性而被大多数学者认为是最理想的分子影像学技术之一[5]，具有非常好的前景，但其敏感度相对较差。靶向性MR分子探针由与靶具有高亲和力的配体(如抗体、肽或小分子化合物)经特定的方法与顺磁性对比剂连接构成，利用靶特异性探针与靶目标直接结合而成像[6]。目前亟需研究开发新型分子探针，使MR不仅具有极高的空间分辨力，还具有较高的敏感性。

图4 各组细胞T2WI信号强度箱图比较Fig.4 Boxplot showed comparisons of T2WI signal intensity of the tubes (a: PC-3 + 7F5@GoldMag, b:PC-3 + non-related IgG @GoldMag, c: SMMC-7721 +7F5@GoldMag, d: SMMC-7721 + non-related IgG@GoldMag).

3.2 纳米金磁微粒及其对MR信号的影响

纳米金磁微粒是具有Fe3O4(核)/Au(壳)结构的复合超顺磁性纳米微粒[4]，本实验首次采用直径50nm的金磁微粒作为MR信号组件，其Fe3O4核直径约20nm，金壳厚度约15 nm，其创新点在于将氧化铁纳米微粒用金壳来包被，使其既具有超顺磁性，又具有胶体金的性质[7]，从而通过表面静电作用、疏水相互作用、蛋白氨基酸残基侧链的巯基与金的作用等[7-9]将其与单抗偶联，可最大限度保留被偶联分子的生物活性，同时操作简便，抗体固定化效率高。与其他MR对比剂相比，优势明显。它本质上仍属于SPIO范畴，对MR信号的影响也主要表现为产生较强的T2负性对比，因此本实验的MR扫描序列以T2WI为主。在操作中将金磁微粒以1%琼脂糖凝胶倍比稀释后4℃放置至凝胶凝固，主要是为了避免金磁微粒沉淀引起的信号不均匀现象。实验结果发现，稀释至1∶640的金磁微粒T2WI信号强度仍显著低于1%琼脂糖凝胶(P=0.000)。更低浓度的金磁微粒对MR信号影响轻微。金磁微粒在临床应用的3.0T场强MR扫描仪条件下具备作为对比剂的条件，基于这一结果，可以认为以金磁微粒作为对比剂所构建的探针能够应用于MR成像。

3.3 7F5@GoldMag对前列腺癌细胞体外MR信号的影响

用高亲和力分子探针来辨认和证实相关受体是分子成像的先决条件。我们用抗人PSCA单抗7F5与纳米金磁微粒偶联构建前列腺癌特异性分子探针7F5@GoldMag，将其与PC-3细胞孵育，行MR扫描，结果发现它可特异性降低PC-3细胞的T2WI信号强度，对SMMC-7721细胞T2WI信号无明显影响。利用类似方法检测无关抗体@GoldMag对两种细胞T2WI信号强度均无明显影响。7F5@GoldMag与PSCA阳性细胞PC-3的特异性结合是其作为前列腺癌特异性分子探针的基础。

本实验结果表明，以PSCA为靶向分子的MR探针7F5@GoldMag用于体外前列腺癌细胞MR成像，可特异性降低PC-3细胞的T2WI信号，从而为下一步体内MR成像实验奠定了基础。

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