物理因子及无机盐对阴香花色苷稳定性的影响

黄思梅，张 镜，张京维

(1.嘉应学院生命科学学院， 广东 梅州 514015；2.广东杉维生物医药集团有限公司，广东 梅州 514015)

物理因子及无机盐对阴香花色苷稳定性的影响

黄思梅1，张 镜1，张京维2

(1.嘉应学院生命科学学院， 广东 梅州 514015；2.广东杉维生物医药集团有限公司，广东 梅州 514015)

以半制备HPLC纯化制备的阴香果实花色苷为样品，研究物理因子及无机盐与阴香花色苷溶液稳定性的关系。结果表明：阴香花色苷溶液100℃条件下的半衰期为4.7h，室内散射光下贮存40d的保存率为92.702%，pH1.0～6.0溶液贮存40d，阴香花色苷时的保存率高于90.0%；0.001～0.01mol/L 的NaCl溶液、FeSO4溶液对阴香花色苷具有护色或增色效果，0.001～0.1mol/L的CuSO4溶液或KCl溶液对阴香花色苷具加速降解的作用，阴香花色苷在0.001～0.01mol/L的ZnSO4、Mg(NO3)2及0.001～0.05mol/L的Ca(NO3)2溶液中，保存率与不含无机盐的保存率无显著差异，但高浓度的ZnSO4、Mg(NO3)2及Ca(NO3)2溶液有促进阴香花色苷降解的作用。研究表明阴香花色苷的稳定性较高。

阴香；花色苷；稳定性；无机盐；物理因子

Abstract：Anthocyanins inCinnamoummum burmanniifruits were extracted with 90% methanol aqueous solution, separated D301 macroporous resin and purified by semi-preparative HPLC, and the effects of physical factors and mineral salts on the stability of the purified anthocyanins were investigated. Their half-degradation time in aqueous solution was 4.7 h at 100 ℃.Their retention rate was 92.702% under indoor scattered light after 40 days of storage; in contrast, that in aqueous solution at pH 1.0－6.0 was more than 90.00% after the same storage period. NaCl and FeSO4 solutions in the concentration range from 1 to 10 mmol/L displayed color-protecting and hyperchromic effects on the purified anthocyanins, respectively. CuSO4 and KCl solutions in the concentration range from 1 to 100 mmol/L accelerated their decomposition. However, 1－50 mmol/L Ca(NO3)2 as well as 1－10 mmol/L ZnSO4 and Mg(NO3)2had no effect on their stability. In the presence of CaNO3, ZnSO4 or Mg(NO3)2 at higher concentrations, the purified anthocyanins were significantly accelerated to be decomposed. These results suggest a higher stability of the anthocyanins purified fromCinnamoummum burmanniifruits.

Key words：Cinnamoummum bumanni；anthocyanin；stability；mineral salts；physical factors

阴香(Cinnamoummum bumannii)为樟科、樟属中一种，系多年生常绿、阔叶乔木，扦插繁殖灌木状。主要分布于我国广东、海南、广西、福建、江西、浙江、湖南等省及东南亚等地。阴香树速生、树冠紧凑、树形美观，叶面积指数大，终年枝叶繁茂，对SO2等的抗性强，是理想的防污染、抗有害气体的绿化树种，是我国东南沿海广东、海南等省常用的行道树[1]。阴香树还因根、皮、叶等可提取药用成分与化工原料而被作为工业林发展树种[2-3]，且因阴香对防治水土流失具突出的效果，近年在广东、海南等将其大量用于水源涵养林发展树种。阴香树在广东每年3月底至4月初开花，8月后果实才开始较快发育，12～1月果实成熟，在具有“冬季天然温室”之称的广东，阴香树果实年产量大，而且含丰富花色苷等多种成分[4]。

花色苷是广泛存在于植物的花、水果、蔬菜中鲜艳天然色素，现已作为食用色素用于果酱、果汁、饮料、糖果等加工食品[5]。除作为着色剂外，花色苷还具有很强的清除自由基、抗氧化等活性，降低低密度脂蛋白胆固醇，抗突变、抗肿瘤、抗过敏，保护胃黏膜，以及降低重金属毒性等多种医疗保健功能[6-10]，是倍受世人青睐的天然活性物质。植物组织中花色苷的含量低，且市售花色苷产品多以水果、蔬菜及粮食等农产品为原料，致使市场价格昂贵，因而新花色苷的研发仍系当今重要的研究课题[11-18]。阴香果实不仅富含花色苷，而且抗氧化活性的稳定性较高[19-20]，开发利用潜力较大，本研究旨在为阴香果实花色苷的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阴香果实成熟期从广东省梅州市采摘，蒸馏水洗净晾干，超低温冰箱保存备用。

HCl、NaOH、NaCl、KCl、Ca(NO3)2、Mg(NO3)2、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、无水乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1525EF分析/半制备 HPLC 美国Waters公司；VIRTIS 冻干机 美国Irtis公司；U-2800紫外-可见分光光度计 日本日立公司；D301大孔吸附树脂 天津市大均科技开发有限公司；EP-1蠕动泵、层析柱(25mm×80mm) 美国Bio-Rad公司；NU-425 CLASSⅡ生物安全柜 美国纽艾公司。

1.3 方法

1.3.1 供试阴香果实花色苷样品的制备

冷冻果实室温解冻，捣碎果肉，90%甲醇溶液与物料混匀浸提30min，离心上清液－18℃过夜，离心收集上清液冻干。粗提物粉末以D301大孔吸附树脂静态吸附精制后再动态吸附精制，80%甲醇解吸，收集主峰洗脱液冻干。精制的花色苷样品以半制备 HPLC纯化，色谱条件以三氟乙酸、甲醇及三蒸水为流动相，梯度洗脱，515nm波长主峰洗脱液冻干，以张镜等[20]方法测定样品总花色苷含量为93.27%。

1.3.2 阴香花色苷特征吸收波长的选择

取适量阴香花色苷样品溶于pH4.0 蒸馏水中，以pH4.0蒸馏水为参比液，用紫外-可见分光光度计在190～1100nm内进行光谱扫描，以500～550nm内的最大吸收波长为检测波长。

1.3.3 温度对阴香花色苷稳定性的影响

取pH4.0的蒸馏水配制成一定浓度的阴香花色苷溶液，分装到三角瓶内，在20～100℃恒温水浴锅内进行热处理，每1h取样测定1次溶液在515nm波长处的吸光度，以pH4.0的蒸馏水为参比液，按以下公式计算花色苷保存率。

式中：Ax为处理后阴香花色苷溶液的吸光度；A0为初始溶液的吸光度。

1.3.4 室内散射光对阴香花色苷稳定性的影响

以1mol/L HCl溶液将调蒸馏水pH值为4.0，加入适量的阴香花色苷溶解，无菌条件下0.22μm微孔滤膜除菌，分装于容器，于透光良好的室内桌面贮放，并以同一室内避光贮放的阴香花色苷溶液为对照，每4d取样测定处理液吸光度，计算花色苷的保存率。

1.3.5 pH值对阴香花色苷稳定性的影响

将花色苷分别配制pH1～10的溶液，0.22μm微孔滤膜除菌后装入三角瓶内，避光28℃恒温贮存，定时精确取一定体积样品液，调溶液的pH值为4.0，静置4h后测515nm波长处的吸光度，乘稀释倍数得处理后样品的吸光度，计算花色苷保存率。

1.3.6 无机盐对阴香花色苷稳定性的影响

将供试无机盐配制成系列浓度(pH4.0)溶液，加入适量的阴香花色苷样品，0.22μm微孔滤膜除菌后装入三角瓶内，避光28℃恒温贮存，定时取样测定各处理515nm波长处的吸光度，计算花色苷的保存率。

1.3.7 数据处理

实验均设3次重复，所有数据以SPSS 13.0及Excel进行统计分析，以 LSR法进行差异显著水平多重比较。

2 结果与分析

2.1 阴香花色苷特征波长的确定

图1 阴香花色苷pH4.0溶液紫外-可见吸收光谱图Fig.1 UV-visible spectrum of anthocyanins extracted fromC. burmanniifruits

由图1可见，阴香花色苷光谱图分别在波长265、343nm和515nm处有吸收峰，500～550nm内的可见光吸收峰为花色苷定量测定通用的吸收峰，以515nm为本研究检测波长。另外，光谱中343nm处吸收峰明显，表明阴香花色苷分子有酰基，而有酰基的花色苷分子不易受水分子攻击，在宽pH值范围表现较高的颜色稳定性[21-22]。

2.2 温度对阴香花色苷稳定性的影响

图2 温度对阴香花色苷稳定性的影响Fig.2 Effect of temperature on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由图2可知，阴香花色苷90℃及100℃处理时，半衰期分别为8.0h和4.7h。统计分析表明30～50℃处理10h内花色苷保存率与初始值无显著差异，而20℃处理的显著高于初始值。60℃以上的热处理阴香花色苷保存率逐渐下降，处理温度越高，保存率下降的幅度越大，80～100℃处理2h后花色苷保存率与初始值的差异极显著。但80℃以上高温处理1h的花色苷溶液因颜色变深，所以保存率高于初始值，可能因高温使花色苷甲醇假碱、查尔酮假碱、烊阳离子及醌式碱4种结构形式的比例改变，显色成分的比例增大[23]。

2.3 室内散射光对阴香花色苷稳定性的影响

图3 室内散射光对花色苷稳定性的影响Fig.3 Effect of scattered light on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由图3可见，花色苷溶液在室内散射光贮存12d时保存率较初始值显著降低，降幅为3.380%。贮放40d时花色苷的保存率为92.702%，与初始值差异极显著，且比相同条件下避光贮存对照保存率低3.8%，而蓝莓花色苷室内散射光下30d的保存率仅为39. 90%[24]，表明阴香花色苷对室内散射光的耐受性较好。

2.4 pH值对阴香花色苷稳定性的影响

由图4可知，pH1～6处理的花色苷溶液贮藏40d时保存率较初始值低，且差异显著，但保存率均高于90%。pH7～10处理的花色苷溶液贮存期中保存率随pH值的增大而急骤降低，贮藏40d时保存率与初始值的差异极显著。虽然阴香花色苷不同pH值下的稳定性与文献报道[25]的其他花色苷较一致，但其降解的速率相对较慢，表明阴香花色苷在酸性条件下的稳定性较好。

图4 pH值对阴香花色苷稳定性的影响Fig.4 Effect of pH on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

2.5 无机盐对阴香花色苷稳定性的影响

2.5.1 NaCl对阴香花色苷稳定性的影响

图5 NaCl对阴香花色苷稳定性的影响Fig.5 Effect of NaCl concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由图5可知，NaCl浓度低于0.01mol/L处理的花色苷溶液贮存40d时保存率都与初始值无显著差异，但与无NaCl的对照花色苷溶液无显著差异，表明低浓度的NaCl都对阴香花色苷具有良好的护色作用。高于0.05mol/L的处理花色苷溶液贮存40d时保存率与对照差异不显著，表明较高浓度NaCl对阴香花色苷的稳定性无不利影响。

2.5.2 KCl对阴香花色苷稳定性的影响

图6 KCl对阴香花色苷稳定性的影响Fig.6 Effect of KCl concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由图6可知，0.1mol/L KCl溶液阴香花色苷保存率最低，贮存40d后降至76.704%，与所有其他浓度处理贮存40d后保存率的差异都极显著。其余浓度之间处理贮存40d后保存率相互间差异不显著，但与初始值及无KCl的对照的差异都极显著，表明阴香花色苷对KCl敏感。

2.5.3 Ca(NO3)2对阴香花色苷稳定性的影响

图7 Ca(NO3)2对阴香花色苷稳定性的影响Fig.7 Effect of CaNO3concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由图7可见，处理浓度为0.001、0.005mol/L Ca(NO3)2溶液的花色苷保存率与对照保存率相当，差异不显著。但浓度高于0.005mol/L处理的花色苷贮存期间保存率不断降解，贮存40d时0.01mol/L的处理与对照差异显著，而浓度0.05mol/L及0.1mol/L处理的保存率与对照差异极显著。

2.5.4 Mg(NO3)2对阴香花色苷稳定性的影响

图8 Mg(NO3)2对阴香花色苷稳定性的影响Fig.8 Effect of Mg(NO3)2concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由图8可知，Mg(NO3)2溶液浓度低于0.005mol/L处理后花色苷溶液贮存效果最佳，40 d保存率与不含Mg(NO3)2的花色苷对照溶液的保存率差异不显著。浓度大于0.01mol/L处理的花色苷溶液，40d内花色苷的保存率下降显著，结果表明，Mg(NO3)2对花色苷稳定性存在不利影响，影响程度随浓度的升高而加大，且彼此间差异极显著。

2.5.5 CuSO4对阴香花色苷稳定性的影响

图9 CuSO4对阴香花色苷稳定性的影响Fig.9 Effect of CuSO4concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由图9可知，不同浓度CuSO4处理的花色苷溶液保存率均低于不含CuSO4的对照花色苷保存率，差异极显著。结果表明，CuSO4对阴香花色苷稳定性的影响较大，阴香花色苷在含CuSO4溶液中褪色快，因而阴香花色苷开发利用中应尽可能避免CuSO4离子对颜色的不利影响。

2.5.6 ZnSO4对阴香花色苷稳定性的影响

图10 ZnSO4处理的阴香花色苷存放30d的保存率Fig.10 Effect of ZnSO4concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

由图10可见，ZnSO4溶液低于0.005mol/L时，花色苷溶液保存率与不含ZnSO4贮存40d的保存率相当，数据统计分析表明其差异不显著。其余较高浓度溶液中花色苷的保存率随贮存期的延长而逐渐降低，而且下降速度较快，8～12d时的保存率较对照的差异达极显著。

2.5.7 FeSO4对阴香花色苷稳定性的影响

由图11可见，FeSO4溶液低于0.001mol/L中时，贮存40d后阴香花色苷的保存率高于初始值，且与无FeSO4对照的保存率高差异极显著。浓度高于0.005mol/L处理对花色苷的稳定性在贮存的前期无不利影响，但后期有促进花色苷的降解作用。结果表明，低浓度FeSO4处理后对花色苷增色效应，但阴香花色苷对高浓度FeSO4敏感。

图11 FeSO4对阴香花色苷稳定性的影响Fig.11 Effect of FeSO4concentration on stability ofCinnamoummum burmanniifruit anthocyanins

3 结论与讨论

3.1 阴香花色苷的热、光与弱酸稳定性较好

阴香花色苷溶液100℃高温度处理降解半衰期为4.7h，60℃处理10h仍高于90.0%，而荔枝果皮花色苷60℃及100℃处理其降解半衰期分别为10.1h与2.56h[26]。pH≤7.0的阴香花色苷溶液在室内散射光与黑暗下贮存40d的保存率均大于90%，红心萝卜花色苷pH5.0溶液贮存30d的保存率低于60%[25]。阴香花色苷光谱图中300～350nm光区吸收峰非常明显，表明阴香花色苷结构存在酰基，所以其颜色的热、室内散射光与酸性条件下的稳定性较好[22]。

3.2 低浓度的NaCl及FeSO4分别具有明显的护色与增色效果

阴香花色苷以NaCl低于 0.01mol/L的溶液处理贮存40d时保存率与初始值的差异不显著，而阴香花色苷在0.001mol/L的FeSO4溶液中贮存40d保存率比初始值高，且差异极显著，表明低浓度NaCl与FeSO4溶液对阴香花色苷分别具有护色与增色效果作用。

3.3 阴香花色苷对KCl、CuSO4敏感

阴香花色苷在0.1mol/L以下的CuSO4与KCl溶液中，保存率均随时间的延长而明显下降，与无盐溶液花色苷的保存率差异极显著，表明CuSO4与KCl均具有加速阴香花色苷降解的作用。

3.4 高浓度ZnSO4、Mg(NO3)2、Ca(NO3)2具加速花色苷降解的作用

阴香花色苷在高于0.05mol/L的Ca(NO3)2、0.01mol/L的 ZnSO4及Mg(NO3)2溶液中，贮存期花色苷的保存率显著低于不含无机盐的对照溶液的保存率，但在低浓度的上述盐溶液对花色苷的保存率无影响。

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Effects of Physical Factors and Mineral Salts on Stability of Anthocyanins fromCinnamoummum burmanniiFruits

HUANG Si-mei1，ZHANG Jing1，ZHANG Jing-wei2
(1. School of Life Sciences, Jiaying University, Meizhou 514015, China；2. Guangdong Shanwei Biomedical Group Co. Ltd., Meizhou 514015, China)

TS214.9

A

1002-6630(2010)13-0069-05

2009-10-17

广东省科技计划项目(2009B011300015)；广东省梅州市科技计划项目(2006A11)

黄思梅(1968—)，女，实验师，主要从事食品及植物生理生化研究。E-mail：hsimei@jyu.edu.cn