生产柑橘皮渣发酵饲料的多菌种优化培养条件*

马亚琴，王华，吴厚玖，孙志高，黄学根，郭莉

(中国农业科学院柑橘研究所国家柑橘工程技术研究中心，重庆，400712)

生产柑橘皮渣发酵饲料的多菌种优化培养条件*

马亚琴，王华，吴厚玖，孙志高，黄学根，郭莉

(中国农业科学院柑橘研究所国家柑橘工程技术研究中心，重庆，400712)

以麦芽汁、马铃薯、红薯为原料配制液体培养基，主要筛选了培养康宁木霉(13016)、黑曲霉(2281)、酵母(1254)等微生物的最佳培养基及扩大培养条件，旨在降低柑橘皮渣发酵饲料成本。试验结果表明:在30℃培养56 h，以马铃薯浆为培养基，木霉产孢量最高;以麦芽汁为培养基，黑曲霉产孢量最高;以红薯块为培养基，酵母的产孢量最高。综合考虑柑橘皮渣发酵的菌种优化扩大培养条件为:以马铃薯浆为培养基，培养温度为30℃，培养时间为56 h。并进行柑橘皮渣发酵中试试验，结果表明皮渣发酵饲料的粗蛋白、粗脂肪含量明显提高，水分和糖类物质含量呈下降趋势。

柑橘皮渣，多菌种，发酵

近年来，柑橘产业发展势头迅猛，产量显著提高，已成为柑橘主产区农业经济的支柱产业之一［1］，为促进农村经济、有效改善生态环境做出了积极贡献。世界柑橘总量的40%左右用于加工，而柑橘深加工必然产生大量的皮渣，约占柑橘总重的50%左右［2］。目前大量的柑橘皮渣并未得到综合利用［3－5］。柑橘皮渣以废弃物处理其成本日益攀升，这使得柑橘皮渣的资源化利用逐渐成为研究人员及柑橘工业关注的热点。以前的研究表明柑橘皮渣营养丰富［6］，可作为动物饲料添加剂。Lo Curto等［7］将工厂产生的柑橘皮渣干燥后作为动物饲料。但柑橘皮渣苦味重，适口性差，蛋白质含量不高，动物吸收低。曾虹燕等［8］的研究认为，橘皮粉作为饲料添加剂，可提高动物抗病性、增加食欲、提高日增重量等;此前的研究表明［9］，利用柑橘皮渣生产发酵饲料，发酵后蛋白质含量、氨基酸含量、维生素含量都得到了增加。汪钊等［10］的研究表明，利用青霉发酵柑橘皮渣其发酵后比发酵前蛋白质含量有明显提高。此外，柑橘皮渣饲料的营养水平也受到柑橘产地和加工因素的影响［11］。由此可见，柑橘皮渣经过多菌种综合发酵，既能提高饲料营养成分，也能改善适口性，其应用前景非常广阔。

本研究在以前工作的基础上，利用多菌种联合快速扩大培养，同时进行柑橘皮渣发酵试验，以期为降低柑橘皮渣发酵饲料成本提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

马铃薯、红薯，购自重庆市北碚区歇马市场;40Brix麦芽汁，中国农业科学院柑橘研究所实验室;柑橘皮渣(北碚447，含水分70%左右)，中国农业科学院柑橘研究所，中试车间FMC全果榨机榨汁后皮渣;黑曲霉(2281)、康宁木霉(13016)，中国工业微生物菌种保藏中心;产朊假丝酵母(1254)，中国农科院柑橘研究所实验室保藏菌种。

1.2 仪器

391 FMC全国榨汁机，美国FMC公司;万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司(北京);Nichipet EX移液枪，上海泽权仪器设备有限公司(泽泉国际集团);WAY－2S阿贝折光仪，上海精密科学仪器有限公司;PHS－3CT酸度计，上海大普仪器有限公司;立式压力蒸汽杀菌器，上海申安医疗器械厂;振荡培养箱，上海博泰实验设备有限公司;控温多用高速组织捣碎机，江苏江阴科研器械厂;UDK－132型半自动凯式定氮仪，意大利velp公司;MS生物显微镜，重庆赛奥光电有限公司。

1.3 方法

培养基的配置:马铃薯培养基的配制:准确称取马铃薯200 g 2份并去皮，一份切成小块，一份打浆。分别加水煮沸30 min，然后用纱布过滤。滤液加葡萄糖20g，尿素2 g，再定容至1 000mL，121℃灭菌20 min。红薯培养基配制方法同上。利用阿贝折光仪测定可溶性固形物含量，各培养基可溶性固形物含量见表1。

表1 不同培养时间下各培养基可溶性固形物含量(0Brix)

培养条件:用移液管准确移取15mL，4.00Brix的麦芽汁糖溶液置入100mL的锥形瓶;并将配制好的马铃薯和红薯培养基分别移取20mL置入100mL的锥形瓶中，设3个重复。121℃下杀菌20min。

在麦芽汁糖培养基中接入木霉、黑曲霉、酵母，30℃振荡培养36 h，用移液枪取0.75mL麦芽汁糖培养物，分别接种到麦芽汁、马铃薯浆、马铃薯块、红薯浆、红薯块的液体培养基中，在相同的条件下分别培养48、56、72 h，按上述方法混合培养木霉、黑曲霉、酵母3种菌种，将含有3种菌种的马铃薯浆培养物依次接入到50 kg新鲜皮渣中，将30℃发酵48 h、72 h后的发酵皮渣烘干，测定其各项营养指标。

皮渣主要营养指标测定:菌数采用显微镜直接计数法测定［12］;水分、粗纤维、粗脂肪以及还原糖、转化糖按国家标准分析方法测定［13］。

1.4 统计分析

所有测得的实验数据都以3个重复的均值±标准差来表示。方差分析(ANOVA)通过SPSS(version 15.0.0［6 Sep 2006，SPSS Inc.］)完成，采用 Duncan多元回归方法分析了在0.05的水平上均值的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对木霉产孢数量的影响

由于柑橘皮渣中含有大量的纤维素，不仅降低了饲用价值，亦降低其他营养物质的利用率，木霉具有分解纤维素的能力［14］。

由图1可以看出，木霉以麦芽汁为培养基，在30℃培养48 h产孢量达到最大。当培养56 h后，木霉产孢量以马铃薯浆为培养基达到最大，比麦芽汁培养基的产孢量提高了13.65%，之后各培养基产孢量明显减少。这表明以马铃薯浆为培养基培养木霉的效果较麦芽汁有所提高，而成本却大大降低。但随着培养时间的延长，马铃薯浆培养基的产孢量较其他几种培养基下降最快，这可能与前期木霉消耗营养过多有关。庄敬华等［15］研究了木霉在30℃分别培养3、5、7d对产孢量的影响，结果表明培养3d木霉产孢量即达到最大。

图1 不同培养基对木霉产孢量的影响

2.2 不同培养基对黑曲霉产孢数量的影响

从图2可以看出，不同的培养基类型对黑曲霉产孢量有显著影响。在30℃培养48 h，在红薯块培养基上黑曲霉的产孢量最高，其次是红薯浆培养基，而马铃薯块和马铃薯浆培养基上黑曲霉的产孢量明显较低。但培养56 h后，黑曲霉的产孢量在红薯块和红薯浆培养基上迅速下降，而在麦芽汁、马铃薯块和马铃薯浆培养基上显著增加，黑曲霉的产孢量在麦芽汁培养基上最高，比马铃薯浆培养基上的黑曲霉产孢量增加了4.65%，较以红薯浆培养基培养48 h后黑曲霉产孢量增加了11.03%。此外，延长培养时间至72 h，黑曲霉的产孢量在各种培养基上均减少。由此可见，在其他培养条件相同的情况下，在30℃培养56 h，尽管以麦芽汁为培养基黑曲霉产孢量最高，但从节约成本考虑，选择以马铃薯浆为培养基30℃、56 h培养黑曲霉最佳。

图2 不同培养基对黑曲霉产孢量的影响

2.3 不同培养基对酵母产孢量的影响

在饲料生产中酵母作为“单细胞蛋白”被广泛应用，酵母含脂肪1%～7%，无氮浸出物30%～40%。它的存在能促进机体对养分的吸收利用，酵母菌的代谢产物具有促进畜禽生长的作用，有利于家畜对营养物质的消化和吸收。

由表2可以看出，在30℃培养56 h，在各种培养基上酵母产孢量均达到最大，但酵母产孢量在红薯块培养基上较其他几种培养基高，比麦芽汁培养基的酵母产孢量提高了5.02%。其次为红薯浆、马铃薯浆和马铃薯块培养基。延长培养时间至72 h，各培养基产孢量均明显下降。为了满足工业化连续生产，从经济的角度综合考虑，进行皮渣发酵饲料的优化培养条件为:以马铃薯浆为培养基，在30℃培养56 h。

表2 不同培养基对酵母产孢量(1014个/mL)的影响

2.4 柑橘皮渣中试发酵试验

为了进一步明确上述3菌种在以马铃薯浆为培养基进行联合培养对柑橘皮渣发酵的影响，本文通过扩大培养微生物试验，对柑橘皮渣中试发酵饲料的营养指标进行了探讨。

发酵前后培养基和柑橘皮渣的pH值和可溶性固形物含量见表3。由表3可知，发酵后可溶性固形物含量显著减少。各培养基的pH值呈碱性，新鲜柑橘皮渣的pH值呈酸性，添加石灰使其pH值到达7，在不同的时间发酵后皮渣的pH值均呈酸性。这表明柑橘皮渣的发酵会引起乳酸发酵［16］。Cullen等［17］的研究也证明，柑橘皮渣发酵后比甜菜皮渣、玉米皮和高粱皮等产生更多的乳酸。因此，为了提高柑橘皮渣饲料的品质，Migwi等［18］建议将柑橘皮渣、小麦秸秆和家禽草料按一定比例混合不仅提高饲料品质又增强了安全性。

表3 pH值和可溶性固形物含量

由表4可以看出，柑橘皮渣发酵在48h后其粗纤维含量增加了52%，粗蛋白增加了6%;发酵72h后粗纤维含量增加了38%，而粗蛋白增加到14.69%，由于通过固态发酵，将柑橘皮渣中非蛋白的氮转化菌体蛋白，因此经发酵的皮渣饲料能有效的提高蛋白质含量。粗脂肪增加不显著，但水分和糖类物质含量呈下降趋势。由此可见，利用马铃薯作为培养基材料替代麦芽汁进行柑橘皮渣发酵试验，其发酵皮渣的粗蛋白含量明显提高，而成本大大降低。此外，饲料中粗纤维含量低，能增加牲畜的适口性，但本试验中粗纤维并未得到有效降解，这很可能是多种菌种同时存在可能会产生消长作用，从而引起某一菌种的作用减弱。有研究认为［14］酵母的快速生长对黑曲霉有一定的抑制作用;而青霉的存在对木霉有效降解纤维素具有一定的协同作用。

表4 发酵前后柑橘皮渣营养指标

3 结论

研究结果表明，在30℃培养56 h，以马铃薯浆为培养基木霉产孢量最高;以麦芽汁为培养基黑曲霉产孢量最高;以红薯块为培养基酵母产孢量最高。但是，黑曲霉在麦芽汁培养基中培养56 h产孢量比在马铃薯浆培养基仅提高了4.65%，而麦芽汁培养基对其他菌种并未表现出优势。综合考虑柑橘皮渣发酵的优化菌种培养条件为:以马铃薯浆为培养基，培养温度为30℃，培养时间为56h。进行皮渣发酵中试试验，结果表明柑橘皮渣发酵饲料的粗蛋白含量明显提高，水分和糖类物质含量呈下降趋势。这表明可以利用马铃薯浆为培养基替代麦芽汁培养基进行柑橘皮渣饲料的扩大发酵试验，在提高柑橘皮渣发酵饲料营养指标的同时，大大降低了生产成本。此外，粗纤维并未得到有效降解。目前笔者对此正在进行进一步的研究。

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Discuss on Optimum Culture Conditions of Multi-microorganisms for Producing Citrus Pomace Feed

Ma Ya-qin，Wang Hua，Wu Hou-jiu，Sun Zhi-gao，Huang Xue-gen，Guo Li
(National Citrus Engineering Research Center，Citrus Research Institute.Chinese Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712，China)

The wort medium as one of most common medium is not suitable for industrialization on a large scale due to high cost.Aiming at reducing cost，this paper takes wort medium，potato，sweet potato as raw materials to screen the optimum culture medium and conditions for viridin，black mold，Candida tropicalis.The results showed that at 30℃ for 56h，the yields of spores produced by viridian reached its peak when using thick liquid potato medium，that by black mold using wort medium，and that by Candida tropicalis using sweet potato piece medium.The optimum culture conditions of multi－microorganisms for producing citrus pomace feed were determined as:thick liquid potato medium，30℃ of culture temperature and 56h of culture time.Furthermore，the pilot experiment for fermenting citrus peel was studied.The results showed that the contents of crude fiber，crude protein and crude fat increased after the fermentation while the contents of water and sugar decreased obviously.

citrus pomace，microorganism，fermentation

博士，副研究员(王华为通讯作者)。

*现代柑橘产业技术体系橙汁加工岗位部分研究内容;“十一五”国家科技支撑计划(2007BAD47B06)

2010－06－18，改回日期:2010－09－15