含酯血红蛋白分子印迹膜的制备

丁安子,方桂杰,高 琴,谢卫红

（湖北工业大学生物工程学院发酵工程省部共建教育部重点实验室,湖北武汉 430068）

含酯血红蛋白分子印迹膜的制备

丁安子,方桂杰,高 琴,谢卫红

（湖北工业大学生物工程学院发酵工程省部共建教育部重点实验室,湖北武汉 430068）

以丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯为功能单体、N,N′2亚甲基双丙烯酰胺为交联剂、牛血红蛋白为模板分子,采用溶液聚合法,合成了具有选择识别性的牛血红蛋白分子印迹膜。结果表明,引入疏水性功能单体甲基丙烯酸甲酯,通过氢键和疏水作用的协同作用,蛋白质印迹膜的专一选择性得到显著提高。

蛋白质分子印迹膜;牛血红蛋白;协同作用

分子印迹技术（Molecular imp rinted technology,M IT）指人工合成具有专一性识别作用受体的新技术。由于其良好的耐热与耐化学性能以及高的专一选择性,在色谱柱固定相及固相提取[1～3]、生物传感器敏感元件[4]、模拟酶催化[5～7]等领域应用广泛。

蛋白质分子印迹技术是以蛋白质为模板的一种大分子印迹技术,一般采用水溶性功能单体并在水相中以氢键与模板蛋白形成复合物,但在水相中形成氢键容易受水分子的干扰,影响了印迹孔穴的形成和印迹聚合物的选择识别能力。研究表明,利用不同功能单体的协同作用可显著提高蛋白质分子印迹聚合物的专一选择性。宓怀风等合成了具有辅助识别聚合物链的新型单体,该单体可与功能单体丙烯酰胺组成多重有效的识别位点,有效提高印迹聚合物的专一选择性[8,9]。Shea等以蜜蜂蜂毒毒素为模板、N,N′2亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,使用丙烯酰胺（AAm）、丙烯酸（AAc）、N2叔丁基丙烯酰胺（TBAm）等多种功能单体,利用多种作用力（氢键、正电荷静电作用力、负电荷静电作用力、疏水作用力）协同作用的方法,提高印迹纳米微球的选择性[10]。

作者在此采用溶液聚合法,以牛血红蛋白为模板蛋白,在使用水溶性功能单体丙烯酰胺的基础上,引入疏水性功能单体甲基丙烯酸甲酯,以N,N′2亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,采用氧化还原引发体系引发聚合反应,在玻片上制备了具有选择性识别能力的含酯牛血红蛋白分子印迹膜。

1 实验

1.1 试剂与仪器

牛血红蛋白（BHb）、肌红蛋白（Mb）、N,N′2亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）,Sigma公司;牛血清蛋白（BSA）,B.M公司;溶菌酶（Lyz）,Am2 ersco公司;丙烯酰胺,Canalab公司;甲基丙烯酸甲酯（MMA）、十二烷基硫酸钠（SDS）、二甲基亚砜（DM 2 SO）、戊二醛,国药集团化学试剂有限公司;32氨丙基三乙氧基硅烷（WD250）,武汉大学新有机硅有限公司;其余试剂均为国产分析纯;实验用水为去离子水。

UV2Lambda 35型紫外可见分光光度计,美国Perkin Elmer公司。

1.2 蛋白质分子印迹膜的制备

含酯印迹膜的制备：取丙烯酰胺84 mg、N,N′2亚甲基双丙烯酰胺9 mg以及甲基丙烯酸甲酯42μL溶于1 mL除氧后的DM SO;以除氧后的p H值为6.40的0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液（PBS）配制2×10-4mol·L-1BHb溶液。等体积混合上述单体溶液和模板蛋白溶液,并在氩气保护下,加入0.1 mg·mL-1过硫酸铵40μL和 TEM ED 6μL。取混合溶液滴于玻片上,使其聚合成膜。生成的印迹膜（M IP）用1%SDS210%HAc洗脱液于脱色摇床上洗脱至紫外检测不到模板分子为止,然后用去离子水洗净残留 SDS。以1 mL PBS代替模板蛋白溶液,同法制备非印迹膜（N IP）。

无酯印迹膜的制备：取丙烯酰胺111 mg、N,N′2亚甲基双丙烯酰胺9 mg溶于1 m L除氧后的PBS,其余步骤同上。引发剂用量为0.1 mg·mL-1过硫酸铵20μL、TEM ED 3μL。

1.3 重结合性能的检测

为了检测M IP膜的重结合能力,向放置M IP膜的烧杯中加入1μmol·L-1BHb溶液3 m L,4℃下静置;每隔一段时间取200μL溶液用紫外分光光度计于405 nm处测其吸光值,计算蛋白浓度,按下式计算重结合蛋白量（B）。

式中：c0为初始蛋白质浓度;ct为不同时间的蛋白质浓度;V为蛋白质溶液体积。

1.4 印迹膜专一选择性

为检测印迹膜的专一选择性,选取Lyz、M b和BSA为参比蛋白。向放置M IP膜及N IP膜的不同烧杯中 ,分别加入10μmol·L-1Lyz溶液、1μmol·L-1M b溶液、1μmo l·L-1BHb溶液、10μmol·L-1BSA溶液各3 m L,4℃下静置10 h。用紫外分光光度计测其吸光值,并计算重结合蛋白量（B）。

2 结果与讨论

2.1 分子印迹膜制备条件的确定

2.1.1 溶剂的选择

MM A不溶于水,考虑到不同溶剂对聚合反应速率的影响[11],以溶解度和能否成膜为标准,考察DM 2 SO、二甲基甲酰胺（DM F）和甲醇三种溶剂的溶解性及对成膜的影响,结果见表1。

表1 不同溶剂的溶解性及对成膜的影响Tab11 Solubility in different solventsand the im pact on the film

由表1可以看出,DMSO与甲醇均具有较好的溶解性,但甲醇无法形成膜状印迹聚合物;DM SO与DM F均可制备分子印迹膜,但DM F对牛血红蛋白的溶解能力要小于DM SO。故选择DM SO作为溶剂。

2.1.2 酯加量的确定

Shea等研究发现,以50%AAc和40%TBAm制得的印迹聚合物重结合蛋白量大于以5%AAm&AAc和40%TBAm制得的印迹聚合物,即多种功能单体以多种作用力协同作用时,存在最佳单体配比[10]。

在此以MMA取代部分AAm,在保证功能单体总摩尔数不变的情况下,研究MMA与AAm的不同配比对印迹膜重结合蛋白量（便于比较,均指单位面积重结合量,下同）的影响,结果见图1。

图1 酯加量对印迹膜重结合蛋白量的影响Fig.1 Effect of MMA dosage on rebinding protein amount on imprinted membrane

由图1可知,随着酯加量的增加,M IP膜重结合蛋白的量逐渐增加;当酯加量增至25%时,M IP膜重结合蛋白量达到最大;随后M IP膜的重结合蛋白量开始减少。由图1还可知,随着酯加量的增加,N IP膜重结合蛋白量增加不明显。

实验发现,随着酯加量的增加,含酯膜的颜色从无色透明逐渐变为乳白色,刚性也显著提高。当酯加量超过25%时,膜变得易碎,且不易从玻片揭下来,影响了对模板蛋白的重结合。

2.1.3 引发剂用量的确定

引发剂用量决定引发体系自由基的量,从而影响聚合度。由于溶剂DM SO造成的阻聚作用[11]以及MMA较低的链增长常数[12],为保证完全聚合需增大引发剂用量。以无酯印迹膜引发剂量（0.1 mg·mL-1过硫酸铵 20μL、TEM ED 3μL）为初始引发剂量,分别提高2～3倍,考察其对含酯M IP膜重结合蛋白量的影响,结果见图2。

图2 引发剂用量对含酯M IP膜重结合蛋白量的影响Fig.2 Effect of in itiator dosage on rebinding protein amount on M IP containing ester

由图2可以看出,当引发剂用量为2倍用量时,含酯M IP膜重结合蛋白量显著提高;继续增大至3倍用量时,含酯M IP膜重结合蛋白量变化不大。这是因为,一方面随着引发剂用量的增加,含酯M IP膜聚合度也增加,形成更多的印迹孔穴;另一方面,随着引发剂用量的增加,聚合速率也加快,聚合时间缩短,DM 2 SO对蛋白的变性作用也减小,有效印迹孔穴增加,因此,当引发剂用量为2倍用量时,印迹膜的聚合度已达到最佳,继续增大引发剂用量,重结合蛋白量无变化。2.1.4 重结合时间的确定（图3）

图3 含酯M IP膜重结合蛋白量随时间变化曲线Fig.3 The change curve of rebinding protein amount on M IP contain ing ester vs.rebinding time

由图3可见,在最初的0～4 h内,含酯M IP膜重结合蛋白量显著增加;在4～8 h时,重结合蛋白量的增加趋缓,8 h后吸附达到平衡。这是因为重结合时,BHb先与膜表面及浅层印迹孔穴发生相互作用,由于膜表层空间位阻小,结合速度快;当浅层的孔穴饱和后,BHb向膜内部印迹孔穴扩散,直至达到静态吸附平衡,此时空间位阻增大,故结合速度变慢。因此,为保证含酯M IP膜与BHb充分结合,后续实验中重结合时间均选择10 h。

2.1.5 BHb浓度的确定

利用静态平衡吸附法在0.1～1.0μmol·L-1浓度范围内进行重结合,结果如图4所示。

由图 4可知,当BHb浓度在 0.1～0.4μmol·L-1范围内,重结合蛋白量显著增加;当BHb浓度在0.4～0.8μmol·L-1范围内 ,增速变缓;当 BHb 浓度超过0.8μmol·L-1时,重结合蛋白量达到饱和。因此,为保证含酯M IP膜与BHb充分结合,后续实验中BHb浓度均选择1.0μmol·L-1。

2.2 选择性吸附

图4 含酯M IP膜在不同BHb浓度下重结合蛋白量Fig.4 Rebinding protein amoun t on M IP contain ing ester at different concentrations of BHb

3种参比蛋白中,溶菌酶（Lyz）作为分子量小、体积小的参比蛋白的代表;肌红蛋白（M b）作为分子量小、体积小但具有类似于模板蛋白结构的参比蛋白的代表;牛血清蛋白（BSA）作为分子量略大、体积近似于模板蛋白的参比蛋白的代表。结果表明,含酯M IP膜对模板蛋白 BHb具有相对较高的重结合蛋白量,Lyz、M b、BSA的重结合蛋白量远小于模板蛋白,这表明含酯M IP膜具有一定的选择性。含酯 NIP膜对4种蛋白的重结合蛋白量较为接近,没有选择性。

以印迹影响因子α来评价印迹膜的专一选择性。

显然,α值越大,表明M IP膜相对于N IP膜对客体分子的识别性越好。

将含酯印迹膜与无酯印迹膜对4种蛋白的重结合量进行对比,结果如图5和表2所示。

图5 含酯印迹膜和无酯印迹膜对不同蛋白重结合蛋白量的对比Fig.5 Contrast of rebinding amoun t of different protein on im printed membrane with ester or without ester

表2 含酯印迹膜和无酯印迹膜对不同蛋白的α值Tab12 The values ofαof different proteins on imprinted membrane with ester or without ester

由图5和表2可知,随着疏水性功能单体MM A的引入,印迹膜对模板蛋白的重结合量显著增加,α值也随之增加,这说明印迹膜的专一选择性得到了提高,这与Shea等的结果相符合[10]。随着选择性的提高（MMA的引入）,3种参比蛋白的α值都有一定程度的降低。尤其是M b,其含酯M IP膜的重结合蛋白量明显减少。这可能是由于引入疏水性功能单体后,通过氢键和疏水作用力的协同作用,提高了含酯印迹膜的专一选择性,可正确识别模板蛋白BHb与其结构类似的蛋白M b。

3 结论

引入疏水性功能单体MMA后,通过与丙烯酰胺的协同作用,所制备的含酯印迹膜对模板蛋白BHb的专一选择性明显提高,尤其是对结构类似蛋白M b的识别能力得到了提高。该法为有效提高蛋白质等生物大分子的印迹聚合物的专一选择性提供了一条新的途径。

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Preparation of Hemoglobin M olecular Imprinted Membrane Contain ing Ester

D ING An2zi,FANG Gui2jie,GAO Qin,XIEWei2hong
（Key L aboratory of Fermentation Engineering for M inistry of Education,College of B ioengineering,H ubei University of Technology,W uhan430068,China）

By aqueous solution polymerization,the bovine hemoglobin molecular imp rinted membraneswere synthesized w ith acrylamide and methylmethacrylate as the functionalmonomers,N,N′2methylenebisacrylam2 ide as the crosslinker,and bovine hemoglobin as the temp late.The results showed that the specific selectivity of bovine hemoglobin molecular imp rinted membrane was significantly increased by introducing hydrophobic monomer methylmethacrylate into the polymer.The increase of the selectivity was due to the cooperation of hydrogen bonding and hydrophobic action.

p rotein molecular imp rinted membrane;bovine hemoglobin;multisite interaction

O 641.3

A

1672-5425（2010）06-0024-04

国家自然科学基金资助项目（20875024/B0509）,湖北省教育厅重大研究项目（Z20081402）

2010-04-19

丁安子（1982-）,男,湖北人,硕士研究生,研究方向：生物化工;通讯作者：谢卫红,博士,教授。