二甲基亚砜对红霉素合成的影响研究

丁盼盼,高淑红,陈长华,叶蕊芳,武 培,马朝安

（1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;2.河南天方药业股份有限公司,河南驻马店 463000）

二甲基亚砜对红霉素合成的影响研究

丁盼盼1,高淑红1,陈长华1,叶蕊芳1,武 培2,马朝安2

（1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;2.河南天方药业股份有限公司,河南驻马店 463000）

分别研究了摇瓶和发酵罐中二甲基亚砜对红霉素合成的影响。通过摇瓶实验确定了适宜的二甲基亚砜体积分数和添加时间,并在15 L发酵罐中考察了二甲基亚砜对红霉素合成代谢的影响。结果表明,在红色糖多孢菌发酵48 h时,向发酵罐的培养基中流加体积分数为0.16%的二甲基亚砜,红霉素效价可达7961 U·mL-1,比对照提高11.6%;二甲基亚砜可以提高羟基化酶——P450单加氧酶的含量,从而提高红霉素产量。

红霉素;二甲基亚砜;生物合成;P450单加氧酶

红霉素（Erythromycin,Er）是一类大环内酯类抗生素,包括红霉素A（ErA）、红霉素B（ErB）、红霉素C（ErC）、红霉素D（ErD）、红霉素 E（ErE）和红霉素 F（ErF）。在临床上广泛应用的是红霉素A,它的抑菌活性最高,最初是从一种放线菌——红色糖多孢菌（S2accharopolyspora ery thraea）中分离出来的[1]。中国药典（95版）规定红霉素成品的生物效价按无水物计算,每1 mg效价不得少于920个红霉素单位。红霉素A的生物合成途径如图1所示[2]。

图1 红霉素A的生物合成Fig.1 Biosyn thesis of erythromycin A

从图1可以看出,欲得到高产率及高含量的红霉素A,红霉素D是一个很关键的中间产物。红霉素D沿两条分支途径转化为红霉素A,途径 I：红霉素D在羟基化酶 Ery K的作用下羟基化,生成红霉素C,然后在甲基化酶 EryG的作用下甲基化,生成红霉素A;途径Ⅱ：红霉素D在 EryG的作用下甲基化,生成红霉素B,然后在Ery K的作用下羟基化,生成红霉素A。

据报道[3],对于羟基化反应,小分子有机溶剂[如二甲基亚砜（DM SO）、乙醇、丙酮等]可使细胞色素P450单加氧酶m RNA量增加,最终使细胞色素P450单加氧酶（Ery K）表达量增加。

作者在此考察了DM SO体积分数和添加时间对红霉素合成的影响,并研究了DM SO对P450单加氧酶含量的影响。

1 实验

1.1 菌种与原料

红色糖多孢菌 HD,华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室保藏菌种。

淀粉、黄豆饼粉、糊精,河南天方药业股份有限公司;其余原料均为市售工业纯。

1.2 培养基

摇瓶种子及罐一级种子培养基（%）：可溶性淀粉2.0,糊精 2.5,黄豆饼粉 2.5,玉米浆 0.8,硫酸铵0.18,氯化钠0.4,碳酸钙 0.2,豆油 3滴 ·瓶-1,消前p H值7.4。装量30 mL·（250 mL）-1。

摇瓶发酵培养基（%）：淀粉5.0,黄豆饼粉3.0,玉米浆 0.4,硫酸铵 0.15,碳酸钙0.4,豆油3滴·瓶-1,葡萄糖25,p H值7.0～7.2。

罐二级种子培养基（%）：淀粉2.0,黄豆饼粉2.5,糊精2.5,玉米浆2.3,硫酸铵0.15,碳酸钙0.2,豆油0.2,消前p H值7.4。

罐发酵培养基（%）：淀粉2.0,黄豆饼粉2.5,糊精2.5,玉米浆2.3,氯化钠0.15,碳酸钙0.2,豆油0.2,消前p H值7.0～7.2。

1.3 方法

1.3.1 种子培养

将种子液于34℃、220～240 r·min-1摇床培养48 h。

1.3.2 发酵培养

摇瓶发酵培养：将接入种子液的发酵液于34℃、220～240 r·min-1摇床培养 168 h。

罐发酵培养：先将甘油管保藏的菌种按10%接种量接入装有60 m L一级种子培养基的500 m L一级种子瓶中,（34±1）℃培养48 h后;再按10%接种量接入装量相同的500 m L二级种子瓶中,同温培养48 h;最后按10%接种量接入装有10 L发酵培养基的15 L发酵罐中,培养7 d。

1.4 分析与检测

（1）P450单加氧酶含量的测定：参照文献[4～6]测定P450单加氧酶含量。

（2）总蛋白含量的测定：采用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量。

（3）糖和氨基氮的测定：参照文献[7],分别采用费林试剂法和甲醛法测定糖和氨基氮含量。

（4）生物效价的测定：参照文献[8],采用管碟法测定红霉素生物效价。

（5）化学效价的测定：参照文献[9],采用磷酸水解法测定红霉素化学效价。

（6）红霉素含量的测定：采用 HPLC法测定红霉素含量。

高效液相色谱仪：717 Plus autosamp ler,2487 Dual absorbance detector,1525 Binary HPLC pump,Waters公司。

色谱柱为反相C18柱RP2C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相为乙腈（色谱纯）∶0.05 mol·L-1磷酸二氢钾（分析纯）缓冲溶液（32∶68）,流速为1 mL·min-1,检测波长为205 nm,柱温为35℃。

2 结果与讨论

2.1 DMSO添加时间对红霉素效价的影响

分别在摇瓶发酵培养 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h时添加0.12%（体积分数,下同）的DM SO,考察其对红霉素效价的影响,结果见图2。

图2 DMSO添加时间对红霉素效价的影响Fig.2 Effect of DMSO adding time on chem ical titre of erythromycin

由图 2 可以看出 ,在发酵 0 h、48 h、72 h、120 h 添加0.12%的DMSO均可提高红霉素效价,且在发酵48 h添加DM SO时,红霉素效价达到最大。因此,确定DMSO最适添加时间为48 h。

2.2 DMSO体积分数对红霉素效价的影响

摇瓶发酵48 h,分别添加0.08%、0.16%、0.24%、0.32%、0.40%、0.48%、0.56%的 DMSO,考察 DMSO体积分数对红霉素效价的影响,结果见图3。

图3 DMSO体积分数对红霉素效价的影响Fig.3 Effect of DMSO volume fraction on chem ical titre of erythromycin

由图3可以看出,DM SO体积分数小于0.32%时,红霉素效价较对照有所提高,最高增加13%;DM 2 SO体积分数为0.40%～0.48%时,红霉素效价与对照相比,增幅不大;DM SO体积分数为0.56%时,红霉素效价降低。这可能是因为DM SO体积分数过高抑制了菌体生长,导致红霉素合成下降。因此,确定DM SO的最适体积分数为0.16%。

2.3 DMSO对红霉素合成代谢的影响

在15 L FUS-15L（A）发酵罐中,于红色糖多孢菌发酵48 h时流加0.16%的DM SO,每隔一段时间取样分析,考察DM SO对红霉素合成代谢的影响。

2.3.1 DM SO对菌体糖耗速率的影响（图4）

图4 DMSO对糖耗速率的影响Fig.4 Effect of DMSO on consum ption rate of sugar

从图4可以看出,DM SO罐的平均糖耗速率（1.0 g·L-1·h-1）比对照罐（0.6 g·L-1·h-1）高。在发酵115 h左右,DM SO罐的糖耗速率出现最低值,只有0.29 g·L-1·h-1。这可能是因为发酵115 h左右,发酵液中营养物质大部分被消耗,导致部分菌体自溶,因而糖耗也相应降低。

2.3.2 DMSO对菌浓的影响（图5）

图5 DMSO对菌浓的影响Fig.5 Effect of DMSO on cell growth

从图5可以看出,对照罐的菌浓在发酵68 h达到48%,DM SO罐的菌浓比对照稍低,为37%。随着发酵不断进行,由于补料、取样等因素使得发酵后期对照罐的菌浓维持在60%左右,DM SO罐在55%左右。可见,流加0.16%的DM SO不会对红色糖多孢菌产生大的毒性。

2.3.3 DMSO对红霉素效价的影响（图6）

图6 DMSO对红霉素效价的影响Fig.6 Effect of DMSO on chem ical titre of erythromycin

从图6可以看出,对照罐和DM SO罐在发酵67 h的效价均为3000 U·m L-1左右;对照罐在发酵72 h后,效价增长缓慢,最终效价为7132 U·m L-1;DM 2 SO罐虽然在发酵72～100 h时,效价增长比对照罐缓慢,但在发酵100 h后增长明显,最终效价达到7961 U·mL-1,比对照罐提高了11.6%。

2.3.4 DMSO对P450单加氧酶含量的影响（图7）

图7 DMSO对P450单加氧酶含量的影响Fig.7 Effect of DMSO on conten t of P450

从图7可以看出,在发酵96 h时,对照罐的 P450单加氧酶含量达到最高值,此时是红霉素合成的最佳时期;在整个发酵过程中,DM SO罐的P450单加氧酶含量基本上高于对照罐;发酵结束,DM SO罐的P450单加氧酶含量达0.825 nmol·mg-1,比对照罐（0.430 nmol·mg-1）提高了0.395 nmol·m g-1。由此推断,DM SO是通过提高羟基化酶——P450单加氧酶的含量来提高红霉素的产量的。

2.4 讨论

DM SO是具有一定毒性的物质,添加量过多,会导致红霉素效价显著下降,因此在合适的时间添加适量的DM SO才会在基本不影响菌体正常代谢的前提下提高红霉素效价。本实验未深入研究DM SO对菌体的负面影响,但因其毒性和化学性质,不可忽略可能带来的潜在不良后果。

3 结论

分别研究了摇瓶发酵和15 L发酵罐中二甲基亚砜对红霉素合成的影响。在红色糖多孢菌发酵48 h时,向发酵罐培养基中流加体积分数为0.16%的二甲基亚砜,红霉素效价可达7961 U·m L-1,比对照提高11.6%。研究DM SO作用机理发现,DM SO是通过提高羟基化酶——P450单加氧酶的含量来提高红霉素的产量的。

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Study on Effects of DMSO on Synthesis of Erythromycin

D ING Pan2pan1,GAO Shu2hong1,CHEN Chang2hua1,YE Rui2fang1,W U Pei2,M A Chao2an2
（1.State Key L aboratory of B ioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,
Shanghai200237,China;2.Henan Topfond Pharm aceutical Co.,L td.,Zhum ad ian463000,China）

The biosynthesisof erythrom ycin by addition of dimethyl sulfoxide（DM SO）into medium in shake flask or in 15 L bioreactor were studied.The suitable volume fraction and adding time of DM SO were deter2 mined through shake flask experiment,and the effects of DM SO on the synthetic metabolism of erythromycin w ere exp lo red in 15 L bio reacto r.The result showed that,in the 15 L bio reacto r,the chemical titre of erythro2 mycin achieved 7961 U·mL-1w hich was increased by 11.6%of the control w hen 0.16%（volume fraction）DM SO w as added into the medium at 48 h of fermentation ofSaccharopolyspora ery thraea.A dding DM SO could increase the content of P450,so that the yield of erythromycin was increased.

erythromycin;dimethyl sulfoxide（DMSO）;biosynthesis;P450

TQ 465.5 Q 93

A

1672-5425（2010）06-0069-04

2010-01-08

丁盼盼（1985-）,女,山东济宁人,硕士研究生,研究方向：微生物发酵;通讯作者：高淑红,讲师。