应用FTA法检测水产品中吸虫囊蚴的初步研究*

陈韶红,张永年,李树清,艾 琳,陈家旭

2.上海出入境检验检疫局

近年来,随着社会的发展,人们的膳食结构及烹饪方式也在逐步发生变化,特别是生食和半生食方式的引入和推广,鲜活鱼类(包括蟹、螺、蛙、龟、鱼)等水产品的摄入量较以往大大增加,使得食源性寄生虫的人体感染率猛增。水产品中华支睾吸虫和并殖吸虫的感染度在许多地区呈上升趋势,并殖吸虫病和华支睾吸虫病在一些大中城市屡见暴发,水产品中寄生虫囊蚴的检测已经成为食品安全的首要问题。传统检测水产品中寄生虫囊蚴的方法是用消化法解剖镜下检查吸虫囊蚴〔1〕,但需要检测人员具有丰富的镜检经验,且有操作时间长、易漏检的缺点,本研究在传统镜检的基础上,建立了FTA法检测水产品中吸虫囊蚴的定量PCR技术,为相关的监督执法、行政的监督监测等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 水产品样本 含华支睾吸虫囊蚴的麦穗鱼(采自广西省北海市);含并殖吸虫囊蚴的溪蟹(采自浙江省永嘉县)、含东方次睾吸虫囊蚴的淡水鱼(采自广西省北海市)。

1.2 主要仪器 PCR仪(美国ThermoPX2),凝胶分析成像系统(Bio-RAD公司Quantity on 4.6.6),低温离心机(美国Thermo公司);直径6mm打孔机(Whatman公司)

1.3 主要试剂

1.3.1 FTA卡(Whatman公司)

1.3.2 FTA卡洗液T E buffer(0.01 mol/L T ris-HCl,pH 8.0 0.1 mmol/L EDTA)(Whatman公司)

1.3.3 2×Taq PCR Master Mix(0.1U Taq Polymerase/L 、500 μ mol/L dNTP 、20mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、100mmol/L KCl、3mmol/L MgCL2 、其它稳定剂和增强剂)-由上海生工生物制品有限公司。

1.3.4 TAE电泳缓冲液(储备液 50×)：Tris碱242g、冰醋酸 57.1mL、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)100 mL,用蒸馏水定容至1000 mL,混匀,室温保存。使用时取2 mL 50×TAE电泳缓冲液,稀释为200 mL工作液(0.5×)即可。

1.3.5 溴化乙锭、琼脂糖、0.1 mmol/L EDTA(pH 8.0)、10 mmol/L T ris-HCl、2%胃蛋白酶 。

1.3.6 Wizard SV Genomic DNA Purification System Promega试剂盒。

1.4 引物合成

1.4.1 华支睾吸虫囊蚴引物合成：引物由上海生工生物技术公司合成(见表1)。

1.4.2 并殖吸虫囊蚴引物合成 由上海生工生物技术公司合成(见表2)。

1.4.3 东方次睾吸虫囊蚴引物合成：由上海生工生物技术公司合成(见表3)。

表1 华支睾吸虫囊蚴引物合成序列

表2 并殖吸虫囊蚴引物合成序列

表3 东方次睾吸虫囊蚴引物合成序列

1.5 方法

1.5.1 华支睾吸虫囊蚴的检测

1.5.1.1 消化法镜检 称取鱼肉300g,捣碎,按1∶5比例加入2%人工胃蛋白酶消化液,37℃消化过夜,用尖底量筒沉淀,取沉渣用解剖镜镜检分离囊蚴。

1.5.1.2 FTA 定量PCR法 ：将1个 、3个、5个 、10个华支睾吸虫囊蚴,分别加入含1g鱼肉的试管中,每管分别加入pH 8.0缓冲液用细玻璃珠匀浆打碎,分别吸取匀浆液 20μ L滴在 FTA 卡上,自然干燥(或56℃5min)直接提取DNA,用打孔机打孔制的一张直径6mm的滤膜片,用FTA卡洗液洗3次,每次5min,凉干后剪碎滤纸片于 PCR反应管中,以提取的DNA为模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带。

PCR扩增：总体积为 100μ L。反应体系为DNA模板剪碎(制好的直径6mmFTA滤膜片一片),2×Taq PCR Master Mix 50μ L;1%BSA 4μ L;10 μ mol/L 引物各 3μ L;ddH2O40μ L 。

反应条件：94℃预变性3 min;94℃变性1min,62℃退火1min,72℃延伸1min,40个循环;72℃延伸10 min。扩增产物长度分别为315bp。

1.5.2 并殖吸虫囊蚴的检测

1.5.2.1 捣碎法镜检 收集阳性溪蟹(或喇蛄)1只,用竹筒和竹棒研磨溪蟹(或喇蛄),用100目铜筛过滤去除蟹壳后置1 000mL尖底量筒沉淀20min,沉淀物解剖镜镜检分离囊蚴。

1.5.2.2 FTA定量PCR法 将分离的囊蚴分别计数,分为1个、3个、5个,分别加入含1g蟹肉的试管中,每管分别加入pH 8.0缓冲液用细玻璃珠匀浆打碎,分别吸取匀浆液20μ L滴在FTA卡上,自然干燥(或56℃5min)直接提取DNA,用打孔机打孔制的一张直径6mm的滤膜片,用FTA卡洗液洗3次,每次5min,凉干后剪碎滤纸片于PCR反应管中,以提取的DNA为模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带。

PCR扩增：总体积为 100μ L。反应体系为DNA模板剪碎(制好的直径6mmFTA滤膜片一片),2×Taq PCR Master Mix 50μ L;1%BSA 4μ L;10 μ mol/L 引物各 3μ L;ddH2O 40μ L 。

反应条件：95℃预变性1 min;94℃变性50s,68℃退火2min,68℃延伸5 min,35个循环;68℃延伸7 min。扩增产物长度为560bp。

1.5.3 东方次睾吸虫囊蚴的检测

1.5.3.1 消化法镜检 称取鱼肉300g,捣碎,按1∶5比例加入2%人工胃蛋白酶消化液,37℃消化过夜,用尖底量筒沉淀,取沉渣用解剖镜镜检分离。

1.5.3.2 FTA定量PCR法：将分离的囊蚴分别计数,分为1个、3个、5个,分别加入含1g鱼肉的试管中,每管分别加入pH 8.0缓冲液用细玻璃珠匀浆打碎,分别吸取匀浆液20μ L滴在FTA卡上,自然干燥(或56℃5min)直接提取DNA,用打孔机打孔制的一张直径6mm的滤膜片,用F TA卡洗液洗3次,每次5min,凉干后剪碎滤纸片于 PCR反应管中,以提取的DNA为模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带。

PCR扩增：总体积为 100μ L。反应体系为DNA模板剪碎(制好的直径6mmFTA滤膜片一片),2×Taq PCR Master Mix 50μ L;1%BSA 4μ L;10 μ mol/L 引物各 3μ L;ddH2O 40μ L 。

反应条件：94℃预变性 5 min;94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min15s,38个循环;72℃延伸5 min。扩增产物长度分别为1 500bp。

2 结 果

2.1 华支睾吸虫囊蚴FTA定量PCR法 用华支睾吸虫成虫作为对照,在1g鱼肉中分别加入1个、3个、5个、10个囊蚴,用试剂盒和FTA法提取囊蚴的DNA,检测华支睾吸虫囊蚴 ITS2基因 CS1/CS2,经PCR扩增,在315 bp可见明显的显带,两种方法电泳胶显带效果一致。

2.2 并殖吸虫囊蚴FTA定量PCR法 用并殖吸虫成虫作为对照,在1g蟹肉中分别加入1个、3个、5个囊蚴,用试剂盒和FTA法提取囊蚴的DNA,检测并殖吸虫囊蚴ITS2基因3S'/A28,经PCR扩增后,在560bp可见明显的显带,两种方法电泳胶显带效果一致。

2.3 东方次睾吸虫囊蚴FTA定量PCR法 在1g鱼肉中分别加入1个、3个、5个东方次睾吸虫囊蚴,用试剂盒和FTA法提取囊蚴DNA。检测东方次睾吸虫囊蚴ITS2基因BD1/BD2,在1 500 bp可见明显的显带,经 PCR后,两种方法电泳胶显带效果一致。

图1 华支睾吸虫囊蚴检测2种方法的比较(试剂盒和FTA法)Fig.1 Comparison of 2 detection methods for the metacercariae of Clonorchissinensis(kit and FTA)

3 讨 论

FTA技术包含一种包埋在过滤基质中蛋白质变性剂、螯合剂和自由基捕捉剂的特殊干燥化学试剂混合物。它对人无毒,用FTA技术收集的核酸可以在室温和高湿度环境下保存多年而不降解。FTA卡的工作原理是样品中感染性病原体在接触FTA时裂解失活,病原体中的核酸则被固定下来。通过简单的一步,从卡上纯化洗脱下来DNA就可以应用于下游扩增实验。FTA技术具有：①节省低温运输样品以及保存样品的低温冰箱的成本。②使有机体快速失活,避免了操作过程中样品污染的风险。③处理样品、分离得到DNA仅需15～30min,缩短、减少分离步骤(4～16h)。④样品处理只需一个简单的洗脱DNA的过程,省去了使用纯化试剂盒的花费。⑤样品需求量最小化(每个样品采集区12～40μ L)因此,可广泛的用于病毒、微生物、寄生原虫等生物DNA的提取。

传统检测水产品中寄生虫囊蚴的方法是,用消化法在解剖镜下检查吸虫囊蚴,但需要检测人员具有丰富的镜检经验、且有易漏检的缺点。Blair等〔2〕通过检测并殖吸虫的ITS2和CO1基因的研究分析并殖吸虫的分类地位,钱宝珍等按 Sugiyama〔3-4〕方法提取囊蚴的DNA,应用随机扩增多态DNA(PCR-RAPD)技术检测并殖吸虫囊蚴分析生物种群间的分子标记,Boris等〔5〕用试剂盒提取螺体中尾蚴和鱼中华支睾吸虫囊蚴的DNA进行PCR扩增,都认为核酸技术检测吸虫囊蚴具有高度的敏感性和特异性。但是Sugiyama和试剂盒提取DNA方法都有步骤较繁琐、时间较长的缺点。随着FTA技术的出现,使得检测时间大大的缩短。

东方次睾吸虫常与华支睾吸虫同时寄生于鱼体内,形态学的鉴定需要有丰富的镜下工作经验,常可能出现误判。因此,作者首次将FTA技术应用于水产品中吸虫囊蚴的检测,根据华支睾吸虫囊蚴ITS2基因CS1/CS2、并殖吸虫囊蚴ITS2基因3S/A28和东方次睾吸虫囊蚴ITS2基因BD1/BD2,把这3种吸虫囊蚴通过核酸检测技术分别鉴定出来,解决了水产品在囊蚴低感染度的情况下,3种不同的吸虫具有完全不同的条带显示位置,达到能检测到每克样品中1个囊蚴水平,从而达到快速、准确检测水产品中囊蚴,适用于食品卫生检验检疫。

〔1〕李朝品.人体寄生虫学实验研究技术〔M〕.北京：人民卫生出版社,2007,225-230.

〔2〕Blair D,Agatsuma T,Watanobe T,et al.Geographical genetic structure within the human lung fluke,Paragonimus westermani,detected from DNA sequences〔J〕.Parasitology,1997,115(Pt4)：411-417.

〔3〕Sugiy ama H,Morishima Y,Kameoka Y,et al.Polymerase chain reaction(PCR)-based molecular discrimination betweenParagonimus westermaniandP.miy azakiiat the metacercarial stage〔J〕.M ol Cell Probes,2002,16(3)：231-236.

〔4〕钱宝珍,沈琦.浙江省卫氏并殖吸虫致病品系 PCR-RAPD分子标记的初步研究〔J〕.中国人兽共患病学报,2006,22(3)：249-252.

〔5〕Müller B,Schmidt J,M ehlhorn H.Sensitive and species-specific detection ofClonorchissinensisby PCR in infected snails and fishes〔J〕.Parasitol Res,2007,100(4)：911-914.