茶多酚对大鼠肾缺血再灌注损伤保护作用实验研究

李华彬

(四川省双流县第二人民医院肾内科 四川 成都 610213)

肾脏的血流量约是心脏的1/4,因此它是一个高血流的器官,对缺血以及缺氧均较敏感,在临床上如遇到严重烧伤、心脏停跳、失血性休克、呼吸抑制、肾移植术、需暂时阻断肾血流的手术、毒物中毒及严重感染等均可导致肾脏的缺血和缺氧。目前许多研究表明在体内多种脏器缺血后重新恢复血流灌注或氧供,细胞功能代谢障碍及结构破坏较缺血时加重,器官功能将一步恶化,这种情况称之为缺血再灌注损伤(ischemic reperfusion injure IRI)。同样肾脏在缺血后重新恢复血液灌注也会出现这一现象。肾脏的缺血再灌注损伤属急性肾损伤范畴,在临床上十分常见。急性肾功能损伤导致的急性肾功能衰竭是临床危重疾病,目前尚无有效防治方法,因此这一病理损伤过程日益引起人们的重视。既往对肾缺血再灌注损伤的防治人们提出了很多技术性和药物性保护措施,但这些措施均没有稳定一致的疗效。而许多研究仅仅局限于动物阶段,应用于人体是否有效还未成定论,所以寻求一种安全、经济、有效、临床上易于接受,并能应用于有计划、长时间缺血之前的预处理方法显得尤为重要。因此今后的研究如能进一步明确肾脏缺血再灌注损伤的发生机制,把握住保护肾功能的时间规律及最佳治疗时间窗,并给予相应处理,则可以最大程度地保护肾功能。茶多酚(TP)是茶叶中的一种主要活性成份,它主要是由儿茶素组成,富含多酚类化合物,有着很强的抗氧化能力和清除ORF的作用[1]。茶多酚的化学组成除酚酸外,主要是以α-苯基苯并吡喃为结构基础的类黄酮化合物,其中羟基取代基作为质子的供体,使其具有特殊的生理功能：主要表现在抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗菌等方面[2]。本研究在建立大鼠缺血再灌注损伤模型的基础上,实验前给予大鼠抗氧化能力很强的茶多酚灌胃预处理,然后在不同时间点上SCr、血清SOD活性、MDA含量;肾组织SOD活性、MDA含量等指标来谈讨茶多酚预处理对大鼠肾缺血再灌注后的保护作用及其机制。

1 材料与方法

选择健康近交系清洁级雄性SD大鼠42只。按体重编号,试验设计为3个大组,A组为假手术组为6只大鼠,B组为单纯缺血再灌注组18只大鼠,其中根据恢复再灌注的时间点又分为3个小组,每组6只大鼠。C组也根据恢复再灌注的时间点又分为3个小组,每组6只大鼠,因为是每个小组之间比较,因此实际上可以看为7个小组之间比较。把42只SD大鼠按体重编号后,由随机数字表产生42个随机数字,将其除以7,根据余数的不同将所有的动物平均分在7个组中,保证各个小组间具有可比性。所有大鼠分组情况对试验检测人员采取盲法。42只雄性SD大鼠适应性喂养1周,术前自由饮食,20%的乌拉坦按1mg/kg腹腔注射麻醉,钳夹鼠唇无疼痛反应,说明麻醉成功。将大鼠仰卧固定在手术台上,常规腹部手术区域消毒,用手术剪沿正中线剪开皮肤,沿腹白线剪开腹肌全层,然后应用肝素盐水2mL(肝素200U/mL)注入腹腔约10min后达到全身肝素化。拉钩将两侧腹壁拉开,用棉签将肠管左置,盐水纱布覆盖,充分暴露右侧肾蒂,用血管钳夹闭右侧肾蒂后,将近端结扎,远端切除,即所有大鼠均切除右侧肾脏。A组大鼠将肠管回纳后关闭腹腔,1h后打开腹腔,自腹主动脉取血5mL后,用低温低速离心机3000转/min离心后取上清液留待检测指标;采取左肾组织约0.3g加入冰生理盐水2.7mL中,用玻璃匀浆器制成10%的组织匀浆,匀浆同样用低温低速离心机3000转/min离心,留取上清液检测指标;其余肾组织放入10%的甲醛液中固定作病理切片。即将大鼠处死。B组大鼠切除右肾后将肠管右置,用盐水纱布覆盖,用无创动脉夹夹闭左侧肾蒂1h后解除夹闭,观察肾脏颜色,肾脏颜色从黑色变为红色表示肾脏恢复血液灌注,然后根据再灌注的时间点：0时刻、2h时刻、24h时刻分别处死各组大鼠,每只大鼠只限取一次标本后处死。留取标本方式同A组。C组在试验前1周给予TP预处理,TP按200mg/kg体重灌胃,灌胃体积为1mL/100g。其余处理同B组。操作过程中向所有动物腹腔中间断注入37℃生理盐水30mL/kg(含庆大霉素32万/L),以保持其血流动力学的稳定以及预防腹腔污染和松钳后出现的一过性低血容量反应。将血清及肾组织匀浆放入－20℃以下的冰箱保存。在采集足够的标本后进行指标的检测。血清肌酐(SCr)应用大型生化仪采用二已酰-肟生化方法检测;肾组织匀浆及血清超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)采用相应试剂盒检测。

2 结果

2.1 茶多酚预处理对大鼠急性IRI所致的SCr的影响(表1)

由表1可以看出,IRI组和TP预处理组复流后每个时间点SCr水平高于对照组(P<0.05),其差异具有统计学意义。再灌注后SCr水平均升高。但2h和24h对比(P>0.05),无统计学差异。TP预处理组SCr水平在相应时点低于缺血再灌注组(P<0.05),其差异具有统计学意义。同组内再灌注2h与24h和缺血1h组比较SCr水平升高,其差异具有统计学意义,结果见表2。

2.2 茶多酚预处理对大鼠急性IRI所致的肾组织MDA的变化

2.3 茶多酚预处理对大鼠急性IRI所致的血清MDA的变化(表3)

由表2,3可以看出,IRI组和TP预处理组复流后每个时间点肾组织MDA水平高于对照组(P<0.05),再灌注后肾组织MDA水平均升高,但组内2h和24h无差异性(P>0.05)。IRI组MDA水平在各时间点上高于对照组(P<0.05),TP组预处理组MDA水平也升高,但与IRI组比较,在各时间点上其水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。IRI组和TP预处理组复流后每个时间点血清MDA水平高于对照组(P<0.05),再灌注后血清MDA水平均升高,但组内2h和24h无差异性(P>0.05)。IRI组MDA水平在相应时间点上高于对照组(P<0.05),TP组预处理组MDA水平也升高,但与IRI组比较,其水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。同组内再灌注2h与24h和缺血1h组比较血清MDA及肾组织均浆MDA水平升高,其差异具有统计学意义。结果见表2,3。

表1 血清Cr含量变化情况(n＝42,假手术组n＝6,,umol/L)

表1 血清Cr含量变化情况(n＝42,假手术组n＝6,,umol/L)

注：与假手术组(A组)比较,①P<0.05;C组相应时点与B组比较,②P<0.05;与组内缺血1h即刻采血组比较,③P<0.05

表2 肾组织MDA水平的变化(n＝42,假手术组n＝6,,umol/L)

表2 肾组织MDA水平的变化(n＝42,假手术组n＝6,,umol/L)

注：与假手术组(A组)比较,①P<0.05;C组相应时点与B组比较,②P<0.05;与组内缺血1h即刻采血组比较,③P<0.05

表3 血清MDA水平的变化(n＝42,假手术组n＝6,,umol/L)

表3 血清MDA水平的变化(n＝42,假手术组n＝6,,umol/L)

注：与假手术组(A组)比较,①P<0.05;C组相应时点与B组比较,②P<0.05;与组内缺血1h即刻采血组比较,③P<0.05

2.4 茶多酚预处理对大鼠急性IRI所致的血清SOD的变化

由表4,5可以看出,IRI组和TP预处理组复流后每个时间点肾组织SOD水平低于对照组(P<0.05),再灌注后肾组织SOD水平均降低,但各组内2h和24h无差异性(P>0.05)。IRI组肾组织SOD水平在相应时间点上低于对照组(P<0.05),TP组预处理组SOD水平也降低,但与IRI组比较,其水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。IRI组和TP组预处理组复流后每个时间点血清SOD水平和对照组比较均降低,但2h和24h无差异性(P>0.05)。IRI组血清SOD水平在相应时间点上低于对照组(P<0.05),TP预处理组血清SOD水平也降低,但与IRI组比较,相应时间点上血清SOD水平均有升高,差异具有统计学意义(P<0.05),与对照组比较无差异(P>0.05)。结果见表4,5。

3 讨论

3.1 肾脏缺血再灌注损失发生的机制

肾IRI的发生机制尚未完全阐明,但许多学说和理论在临床和基础实验中已基本得到证实。发生机制主要为大量氧自由基(OFR)形成、白细胞浸润、细胞内钙超载及能量代谢障碍等。急性肾缺血再灌注损伤和保护作用是一个十分复杂的过程,OFR在缺血再灌注损伤中起了重要作用,并得到公认。正常情况下,肾脏的抗氧化能力与不断产生的OFR的氧化能力之间保持着相对动态平衡,不会引起组织细胞的损伤。如果OFR的产生异常增多,或肾脏的抗氧化能力下降,就将导致肾脏组织细胞的损伤。肾脏的氧供应十分丰富,OFR产生的机会相对较多,是机体内最容易产生OFR的器官之一。肾内OFR来源十分广泛,其中肾小球内皮细胞发生缺血再灌注过程是OFR产生的途径之一。机体同时也存在清除OFR的酶系统,一般情况下,其产生与清除处于平衡状态。再灌注时OFR大量产生,而酶系统由于缺血缺氧处于抑制状态无法清除OFR,使得其大量堆积。OFR具有强大的生物活性,它攻击生物膜发生脂质过氧化发应,可以损伤生物膜,使它们失去正常的生物结构和功能,引起细胞功能和能量障碍进而引发一系列的病理改变[3]。同时,过氧化脂质最终分解为丙二醛(MDA),MDA也具有细胞毒性作用,从而加剧IRI。细胞内钙超负荷通过3个环节导致细胞凋亡：激活磷脂酶;直接和间接损害膜的通透性;破坏细胞骨架连接。早期研究证实肾缺血再灌注损伤时可出现Ca2+大量内流,肾缺血后,肾小管上皮细胞内Ca2+浓度明显升高,从而使细胞内磷脂酶活力增加,更多磷脂酶分解为游离脂肪酸,另外Ca2+浓度增加使Ca2+-ATP酶活力增加,从而消耗了更多ATP。Ca2+本身又可通过OFR途径造成组织损伤。钙超载与OFR的产生是肾IRI的重要因素,二者相互影响,协同作用,导致IRI加重。既往认为生理剂量一氧化氮(NO)对肾脏有保护作用,NO通过生理性调节血管紧张性,抑制血小板聚集,减少白细胞粘附于血管内皮细胞,清除OFR,维持血管渗透压,抑制平滑肌细胞增殖,免疫防御,刺激内皮细胞再生等作用保护肾脏。但部分研究者认为NO对缺血再灌注后的肾脏主要起损害作用,Yin等[4]认为肾缺血/再灌注早期就有大量活性氧产生,与此同时NO大量出现,有可能生成毒性更强的过氧亚硝酸阴离子(ONOO-),研究证实肾缺血再灌注时肾小管上皮细胞的损伤是由ONOO-所致,ONOO-具有较大的细胞毒性对移植器官造成损伤。另外还有白细胞浸润、细胞因子参与、粘附分子及中性粒细胞的聚集、能量代谢障碍等也参与肾IRI的发生机制。

3.2 肾脏缺血再灌注损失时肾脏的变化

肾移植中的IRI,近端肾小管表现为细胞变性、坏死、脱落、管型形成、充血以及多形核中性粒细胞的浸润,远端肾小管表现为凋亡。肾小球组织则出现中性粒细胞的大量聚积,这些中性粒细胞与肾血管内皮相互作用,产生炎症反应,使肾血管阻力增加,而且肾缺血缺氧时血管紧张素Ⅱ、内皮素等缩血管物质生成释放增多,引起肾血管收缩,产生再灌注时无复流现象进一步加重肾小球灌注不良,导致肾小球结构功能的破坏[5]。严重的IRI可使移植肾功能延迟恢复、促进急性排斥的发生。而且,作为一个主要的非抗原依赖性因素可直接导致慢性移植肾病,对短期及长期移植肾功能均有不良影响。

表4 血清SOD水平的变化(n=42,假手术组n＝6,,umol/L)

表4 血清SOD水平的变化(n=42,假手术组n＝6,,umol/L)

注：与假手术组(A组)比较,①P<0.05;C组相应时点与B组比较,②P<0.05;与组内缺血1h即刻采血组比较,③P<0.05

表5 肾组织SOD水平的变化(n＝42,假手术组n＝6,umol/L)

3.3 茶多酚预处理对大鼠缺血再灌注损伤所致SCr影响

IRI时肾小管表现为细胞变性、坏死、脱落、管型形成、充血以及多形核中性粒细胞的浸润;肾小球组织则出现中性粒细胞的大量聚积,同时大量OFR攻击生物膜,使它们失去正常的生物结构和功能,引起细胞功能和能量障碍,这些均导致肾脏功能受损,我们知道只要30%肾单位的功能存在SCr就可以维持正常水平,而SCr水平显著升高意味着存在严重的肾功能损伤。本研究显示,缺血再灌注后SCr水平明显升高,TP预处理组升高较单纯缺血再灌注组为轻,差异有统计学意义,说明TP保护了缺血再灌注后的肾脏,减少了损伤。肾IRI主要影响外髓质和皮髓交界处的近端肾小管,因为该部位对缺血、缺氧最敏感。肾小管上皮细胞正常功能依赖于其结构的完整性,肾脏IRI可导致大量的肾小管上皮细胞坏死,损伤严重时还出现基底膜断裂,肾小管塌陷,导致肾功能急剧下降,最后引起急性肾功能衰竭。传统的观点[6]认为肾小管上皮细胞具有强大的增植修复能力,急性肾脏缺血再灌注损伤可以完全逆转,不留有慢性损害。但肾小管上皮细胞增植修复能力是有限的,它依赖于存活的小管细胞的数目和小管基底膜的完整性,如果损伤超过了一定限度,病理性的修复难以避免。那么许多研究基于这样的机理,希望能够在再灌注时尽量减少损伤,尽量保护肾小管的细胞数目,这样在将来的修复过程中能够最大程度的保护移植肾脏的功能。本研究结果显示TP对肾IRI具有保护作用,其病理切片我们可以看到TP预处理组主要表现为肾小管肿胀为主,个别呈现坏死样改变,肾间质水肿、充血、炎性细胞浸润不明显,其肾小管基本保持完整。因而其SCr水平相比无保护组要低,充分体现了TP对缺血再灌注肾脏的保护作用。而TP预处理的最佳方案如最佳治疗时机、最佳治疗剂量等以及其对肾脏的各种保护机制的内在联系还有待于进一步研究。

3.4 TP对大鼠缺血再灌注损伤所致血清及肾组织SOD和MDA水平的影响

SOD是体内清除OFR的重要酶系之一,是抗氧化指标之一,其作用底物主要是OFR中超氧阴离子O2-。在生物体内SOD将O2-歧化为H2O2,H2O2在过氧化氢酶和过氧化物酶的作用下变为H2O,从而解除O2-对生物体细胞损伤,起到保护作用。由于缺血再灌注时产生了大量的OFR,而OFR具有强大的氧化活性,对几乎所有的生物分子都有损伤,尤其对脂质最为敏感。OFR与细胞膜、线粒体膜、溶体膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化作用,产生的过氧化脂质(LPO)可以损伤生物膜。过氧化脂质最终产物为丙二醛(MDA),MDA也具有细胞毒性作用,从而加剧IRI。因此体内如SOD活性增加就会增加对抗OFR的作用,使得脂质过氧化反应减少,SOD活力的测定与MOD含量的测定相配和,SOD活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力,而MOD含量的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。因此如若血清中的SOD活性增加,MDA含量减少可以反映对缺血再灌注脏器的保护作用。研究表明TP是一种强抗氧化剂。TP对食用油脂的抗氧化能力为维生素E、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)的3～9倍[7]。奥田拓男[8]以大白鼠肝线粒体和微粒体模拟体内脂质过氧化试验,结果TP的抑制效果比维生素C和维生素E高18倍和16倍。TP是茶叶中的一种主要活性成份,它是由茶叶中提取的黄烷醇类、黄烷双醇类、类黄酮类和酚酸类四类化合物的总称,有着独特的抗氧化效果。TP是一类含有多酚羟基的化学物质,其抗氧化特性通过下述几种途径体现。首先,TP的酚羟基能作为供氢体,提供质子H+,将单线态氧还原成活性较低的三线态氧,减少OFR产生的可能性;并能夺取过氧化过程中产生的脂质过氧化自由基,生成活性较低的多酚自由基,打断自由基氧化链反应,有效清除体内自由基。比较TP和几种常用的抗氧化剂,如维生素E、维生素C、迷迭香(RA)、姜黄素(Cur),TP具有的抗氧化、抗诱变、神经保护、抑制肿瘤发生、降血脂和心血管系统中对活性氧自由基的清除情况,可以看到TP对活性氧自由基的清除能力明显大于常用的抗氧化剂。它同时可以作用于自由基有关的酶系。目前对于肾脏应用TP预处理研究其对IRI保护作用的研究大多数只限于动物试验阶段,人类的肾脏是否存在TP预处理的效应,临床上研究报道很少。但有研究证实TP是非常安全的,至今在茶叶中还未发现具有一定毒性的单体酚类化合物,例如儿茶酚,所以TP对人体是绝对安全的。如果TP对人体确有有效的抗氧化作用,那么临床上存在很多合适的病例,如果这些病例能从中获益对临床治疗将是很大的贡献。特别是肾脏移植手术,就可以提前给以TP预处理。本次试验笔者只观察了一种剂量的TP预处理方案,是否是TP的理想治疗剂量还需要进一步的研究。

综上所述,TP预处理对肾脏IRI有保护作用,对防治IRI具有重要的研究意义,并且为加强肾脏移植的保护提供理论依据。

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