沉默SIRT1基因表达对胰腺癌细胞PANC1增殖和凋亡的影响

赵刚 崔静 王春友

·论著·

沉默SIRT1基因表达对胰腺癌细胞PANC1增殖和凋亡的影响

赵刚 崔静 王春友

目的应用RNA干扰技术沉默胰腺癌PANC1细胞的SIRT1基因表达，观察其对细胞增殖和凋亡的影响。方法构建靶向SIRT1基因表达的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒pGC-shRNA，转染胰腺癌细胞PANC1。设对照shRNA(shRNA-C)转染组和未转染对照组。实时定量PCR和免疫细胞化学法检测转染后细胞SIRT1 mRNA及蛋白的表达；MTT法检测细胞的增殖率；ELASA法检测细胞caspase-3和caspase-9活性；Western bloting检测细胞Bax、Bcl-2蛋白表达。结果与未转染组相比，shRNA组转染后48 h，PANC1细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为(76.2%±10.4)%和(80.1±11.6)%；细胞增殖抑制率为(45.1±6.5)%；caspase-3和caspase-9酶活性显著增高；Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调。结论应用RNA干扰技术能有效沉默PANC1细胞SIRT1基因的表达，其机制可能与caspasa酶活性升高及Bax表达上调、Bcl-2表达下调有关。

胰腺肿瘤； SIRT1； RNA，小分子干扰； 细胞增殖； 凋亡

沉默信息调节因子-2(silent information regulator 2，Sir2)基因最早发现于酿酒酵母中[1]，其在哺乳动物细胞中的同源基因Sirtuinl(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)介导多种影响细胞周期的转录因子和调节细胞代谢状态，其主要功能是在应激条件下减少细胞凋亡或衰老，增加细胞自我修复和存活的概率[2-3]。但SIRT1对于具有无限生长能力的肿瘤细胞的功能尚不明确。本实验应用RNA干扰技术沉默人胰腺癌PANC1细胞SIRT1基因的表达，观察其对PANC1细胞生长增殖及凋亡的影响。

材料和方法

一、重组质粒构建与鉴定

针对SIRT1(NM_012238)靶基因序列CCTTCTGTTCGGTGATGAA(487-505)设计小发卡RNA(shRNA)，正义链为5′-AAGGAGTGGATTGTCGTC-CCGCACGAGTGTTAGGACAGGGGACGACAATCCACT-CCTTGTATAGACAGTGACCACTACCGCGCAAGGAGA-TCT-3′，反义链为5′-CTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCACCTTCTGTTCGGTGATGAAAAG-TGAAGCCACAGATGTATTTCATCACCGAACAGAAGG-3′；同时设计无同源性的对照shRNA(shRNA-C)，正义链5′-GATCCGGTIATGTACAGGAACGCATTCAAGA-GATGCGTTCCTGTACATAACCTTTTTTGGAAA-3′，反义链5′-AGCTTTTTCCAAAAAGGTTATGTACAGGAA-CGCATCTCTTGAATGCGTTCCTGTACATAACCG-3′。以上引物两端分别有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点，均由上海吉凯公司合成。经95℃ 5 min退火，形成互补双链DNA。

真核表达质粒pGC-silencer-CRM30购于上海吉凯公司，该质粒含CMV启动子，编码GFP报告基因和neo抗性基因。在T4DNA连接酶(Promeg公司)作用下，将上述两种shRNA分别插入经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切线性化的pGC-silencer-CRM30，构建重组质粒pGC-shRNA和pGC-shRNA-C。然后转化感受态DH-5 大肠杆菌，经卡那霉素筛选扩增后，提取质粒，应用酶切和测序鉴定。

二、细胞培养和转染

常规培养人胰腺癌细胞株PANC1。取对数生长期细胞，以2×105/孔接种至6孔板中。实验分为3组：未转染组、shRNA转染组和shRNA-C转染组。待细胞达到60%～80%融合后，采用LipofectamineTM2000将重组质粒pGC-shRNA和pGC-shRNA-C转染细胞，常规培养6 h后更换完全培养基。同时设未转染质粒的细胞作为对照组。每组均分为24、48、72 h 3个时间点。

三、细胞SIRT1 mRNA检测

用Trizol提取转染后细胞的总RNA。SIRT1上游引物5′- CGGAAACAATACCTCCACCTGA-3′，下游引物5′-GAAGTCTACAGCAAGGCGAGCA-3′，扩增产物242 bp；内参GAPDH上游引物5′-GACAACTTTGGCATCGT-3′，下游引物5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′，扩增产物133 bp。先逆转录成cDNA，然后行实时荧光定量PCR。PCR反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，45个循环。在延伸的过程中搜集荧光信号，采用FTC-2000荧光PCR仪自带的实时荧光定量PCR分析程序分析CT(cycle threshold)值。目的基因mRNA相对表达量=2-ΔCT，其中ΔCT=待测样本(CT目的基因-CTβ-actin)。

四、细胞SIRT1蛋白表达检测

制备转染细胞的细胞爬片，4%多聚甲醛固定，常规免疫组化染色。兔抗人SIRT1多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗购自美国Santa Cruz公司；鼠抗人Bax、Bcl-2、β-actin单克隆抗体及免疫细胞化学试剂购自武汉博士德公司。以细胞胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达。随机计数200个细胞，计算阳性表达细胞占总细胞数的百分率。

五、细胞增殖能力检测

采用MTT法。96孔板中每孔接种细胞1×103(200 μl)，于转染后12、24、48、72、96 h每孔加入0.5%MTT 25 μl，继续培养4 h，弃上清液，加入DMSO 150 μl/孔，充分振荡10 min，酶标仪测定各孔A570值。每组每时间点设6个复孔，取均值。

六、Caspase-3和caspase-9酶活性检测

收集转染后24、48、72 h细胞，提取蛋白并测定蛋白浓度。按照caspase-3、caspase-9检测试剂盒(南京凯基公司)说明书操作。每组设3个复孔，取其平均A405值。

七、细胞SIRT1、Bax、Bcl-2蛋白的表达

取转染后48 h细胞，用细胞裂解液，抽提细胞蛋白。取40 g蛋白行Western blotting，ECL发光。以β-actin作为内参。计算机扫描图像，以目的蛋白与β-actin灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。每个样本重复检测3次。

八、统计学方法

结 果

一、重组质粒测序鉴定及细胞转染

重组质粒经酶切后可见900 bp左右的DNA 片断，经测序表明，插入片断序列完全正确(图1)。重组质粒pGC-SIRT1和pGC-SIRT1-C转染细胞48 h后，转染效率为50%左右。

图1 shRNA(上) 和shRNA-C(下)的测序结果

二、细胞SIRT1 mRNA表达的变化

shRNA转染组细胞SIRT1 mRNA表达明显被抑制。以未转染组为标准，转染后24、48、72 h SIRT1 mRNA的表达抑制率分别为(68.4±12.2)%、(76.2%±10.4)%、(79.2%±6.4)%；shRNA-C转染组的SIRT1 mRNA表达无明显被抑制(图2)。

注：与未转染组比较，aPlt;0.01

三、细胞SIRT1 蛋白表达的变化

shRNA转染组细胞SIRT1蛋白阳性表达细胞数量明显减少。以未转染组为1，转染后24、48、72 h SIRT1蛋白阳性表达的抑制率分别为(69.0±9.3)%、(80.1±11.6)%、(81.0±2.0)%；shRNA-C转染组的SIRT1阳性表达率无明显被抑制(图3)。

图3未转染组(a)、shRNA组(b)和shRNA-C组(c)细胞SIRT1蛋白阳性表达及表达量(d)

四、细胞增殖率的变化

shRNA转染组转染后48、72、96 h细胞增殖抑制率分别为(21.7±13.4)%、(45.1±6.5)%、(48.0±8.3)%；shRNA-C组细胞增殖率未受抑制(图4)。

五、细胞caspase-3、caspase-9 活性的改变

shRNA 转染组caspase-3、caspase-9活性随时间延长逐渐升高，其中48、72 h 与未转染组和shRNA-C组间有显著性差异(图4，Plt;0.05)。

六、细胞SIRT1、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的变化

shRNA转染组72 h点的SIRT1和Bcl-2蛋白表达量较未转染组及shRNA-C组明显减少，而Bax蛋白表达量明显升高(P值均lt;0.01)；shRNA-C组与未转染组间的蛋白表达水平无显著性差异(图4)。

讨 论

SIRT1是烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性的去乙酰化酶，是细胞处于应激状态时促进防御和存活的一种关键酶[4]。在正常组织和器官中，其活化效应表现为抑制细胞进入衰老状态，并延长寿命。研究表明，SIRT1可通过去乙酰化抑制p53的转录活性，抑制p53介导的细胞凋亡；在突变细胞中，过量表达的SIRT1可以增强细胞对环境的应激适应能力，提示SIRT1在调控p53信号通路以及调节细胞应激反应中发挥关键作用[5]。也有研究者发现，SIRTI可通过调节细胞凋亡相关基因Bax的功能抑制凋亡的发生，Bax与DNA修复因子Ku70结合，形成复合物，只有Ku70被乙酰化，Bax才会被释放，而SIRT1可使Ku70去乙酰化，阻止Bax转位到线粒体，从而抑制细胞凋亡[6]。然而，在肿瘤组织中，SIRT1的活化使得肿瘤细胞在体内抑癌因素的作用下获得更多进行自我修复、调整和增加存活的机会，持续增值，并较少发生凋亡。在乳腺癌和结肠癌细胞中，Pruitt等[7]发现SIRT1抑制剂可激活抑癌基因活性；在抑癌基因HIC1(hypermethylated in cancer1)敲除鼠形成的肿瘤中，SIRT1表达活性增加，使p53活性降低，参与了肿瘤的形成[8]。

图4 各组细胞增殖率(a)、caspase-3(b)和caspase-9(c)的活性及SIRT1、Bax、Bcl-2蛋白的表达(d)

本实验选择高表达SIRT1基因的胰腺癌PANC1细胞为研究对象，运用shRNA，通过真核表达载体体外转染技术，特异性阻断细胞SIRT1表达。结果显示，SIRT1沉默效应在转染后48 h最为明显，以后基本趋于稳定。PANC1细胞增殖被抑制。Caspase家族的激活在细胞凋亡过程中起着关键的作用[9]。活化的caspase-3 能裂解DNA修复相关分子、凋亡抑制蛋白、细胞外基质蛋白及骨架蛋白等，促使细胞凋亡。本结果显示，shRNA转染组细胞caspase-3、caspase-9活性显著增高，并呈一定的时间依赖性。这与Ford等[10]在结肠癌细胞系中观察到的结果相似。我们推测，抑制细胞SIRT1基因表达后，减少了其对caspase酶的抑制作用，从而抑制细胞生长，促进细胞凋亡。同时，SIRT1转染组细胞在转染72 h时，Bax蛋白表达水平上调，Bcl-2蛋白表达水平下调，也说明SIRT1可通过Bax/Bcl-2途径调节细胞的凋亡过程。

[1] Rine J,Herskowitz I.Four genes responsible for a position effect on expression from HML ANS HMR in Saccharo myces cerevisiae.Genetics,1987,116: 9-22.

[2] Borra MT,Smith BC,Denu JM.Mechanism of human SIRT1 aetivation by resveratrol.Biol Chem,2005,280:17187-17195.

[3] Hisahara S,Chiba S,Matsumoto H,et al.Transcriptional regulation of neuronal genes and its effect on neural functions: NAD+-dependent histone deacetylase SIRT1(Sir2).Pharmacol Sci,2005,98:200-204.

[4] Archer SL. Pre-B-cell colony-enhancing factor regulates vascular smooth muscle maturation through a NAD+-dependent mechanism: recognition of a new mechanism for cell diversity and redox regulation of vascular tone and remodeling.Cire Res,2005,97:4-7.

[5] Luo J,Nikolaev AY,Imai S,et al.Negative control of p53 by Sir2alpha promotes cell survival under stress.Cell,2001,107:137-148.

[6] Cohen HY,Miller C,Bitterman KJ,et al.Calorie restriction promotes mammalian cell survival by inducing the SIRT1 deacetylase.Science,2004,305:390-392.

[7] Pruitt K,Zinn RL,Ohm JE,et al.Inhibition of SIRT1 reactivates silenced cancer genes without loss of promoter DNA hypermethylation.PLOS Genet,2006,2:e40.

[8] Chen WY,Wang DH,Yen RC,et al.Tumor suppressor HIC1 directly regulates SIRT1 to modulate p53-dependent DNA-damage responses.Cell,2005,123:437-448.

[9] Chen JC,Lu KW,Lee JH,et al.Gypenosides induced apoptosis in human colon cancer cells through the mitochondria-dependent pathways and activation of caspase-3.Anticancer Res,2006,26:4313-4326.

[10] Ford J,Jiang M,Milner J.Cancer-specific functions of SIRT1 enable human epithelial cancer cell growth and survival.Cancer Res,2005,65:10457-10463.

2009-07-28)

(本文编辑：吕芳萍)

EffectsofsilencingSIRT1geneexpressiononproliferationandapoptosisofpancreaticcancercelllinePANC1

ZHAOGang,CUIJing,WANGChun-you.

DepartmentofPancreaticSurgical,Unionhospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

WANGChun-you,Email:chunyouwang52@126.com

ObjectiveTo investigate the effects of SIRT1 gene expression inhibited by shRNA on proliferation and apoptosis of pancreatic carcinoma PANC1 cells.MethodsThe eukaryotic expression plasmid of short hairpin RNA (shRNA) targeting SIRT1 gene (SIRT1-shRNA) was constructed as pGC-shRNA and transfected into PANC1 cells. There were shRNA-control transfection group and untransfection control group. The expressions of SIRT1 mRNA and protein were detected with real-time PCR and immunocytochemistry assay, respectively. The growth rate of PANC1 cells was detected by MTT. Activity of caspase-3 and caspase-9 were detected by ELASA. Expressions of Bax, Bcl-2 proteins were determined by Western blotting.ResultsCompared with untransfected group, the inhibition rate of expressions of SIRT1 mRNA and protein were (76.2±10.4)% and (80.1±11.6)%, cytostasis rate was (45.1±6.5)%, caspase-3 and caspase-9 activity was significantly increased, Bax protein was up-regulated, while Bcl-2 protein was down-regulated 48h after transfection.ConclusionsRecombinant expression plasmid SIRT1 shRNA could significantly inhibit the expression of SIRT1 gene, and the mechanism may include increased caspase-3 and caspase-9 activity and Bax protein up-regulation, as well as Bcl-2 down-regulation.

Pancreatic neoplasms; SIRT1; Small interfering RNA; Cell proliferation; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.010

国家自然基金资助项目(30600594)

430022 湖北武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科

王春友，Email:chunyouwang52@126.com