质粒
- 大肠杆菌必需基因的CRISPR-Cas9敲除策略及高效质粒置换方法
[5]报道了一种质粒改组的酵母必需基因编辑方法。将待编辑的必需基因yfeg克隆至回补质粒并使用URA3作为选择标记。在含有5-氟乳清酸的平板培养时,可筛选出无回补质粒的基因编辑菌株。该方法可以实现对必需基因的功能表征,但是选择标记筛选方法也可能使细胞发生突变进行逃逸。CRISPR/Cas9作为第三代基因编辑技术,自问世以来就广泛用于细胞基因组的编辑[6-7]。Cas9可在向导RNA(sgRNA)的靶向作用下被引导至目标基因靶点位置进行切割产生双链断裂,诱导
食品与发酵工业 2023年18期2023-10-09
- 新疆牛羊源金黄色葡萄球菌D353质粒pD353序列分析
言【研究意义】质粒是染色体外的遗传物质,携带遗传信息,并能够通过接合的方式有效进行遗传信息的水平转移,进而增强细菌对不同环境的适应能力[1]。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)及耐万古霉素金黄色葡萄球菌(Vancomycin resistantStaphylococcusaureus,VRSA)的出现是有危害的。在当前具有感染性的金黄色葡萄球菌菌株中,抗生素的耐药性通常
新疆农业科学 2023年7期2023-07-28
- 质粒DNA实验室规模化制备工艺
239000细菌质粒DNA（plasmid DNA，pDNA）通常是小的（平均80 kb）环状染色体外DNA元件，以游离形式持续稳定地存在于染色体外，能够通过招募宿主细胞机制进行半自主复制，可携带有助于宿主适应新环境的基因或编码特异性功能的基因。质粒作为载体应用于基因治疗领域具有两大优势：（1）基因转移过程中，质粒载体具有低毒性、低免疫原性，可耐受核酸酶且转移效率与遗传物质大小无关［1］；（2）在基因编辑时，质粒可作为编辑工具CRISPR/Cas9系统表达
山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报 2023年3期2023-05-05
- 基因工程中载体概述
，克隆载体可分为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体载体等。1 质粒载体质粒（Plasmid）是人们广泛应用的克隆载体。它是细菌和真菌等细胞内独立存在的一种环状DNA分子。几乎所有的质粒都带有一个或多个基因。质粒不影响宿主细胞的生存，但其带有特殊功能的基因可以赋予宿主细胞某些抵御外界不利环境因素的特性。1.1 质粒的生物学特性1.1.1 质粒的复制几乎所有的质粒都含有复制起点。质粒侵染宿主细胞后，不同质粒复制的方式不同。根据是否携带一套促进DNA转移
中学生物学 2022年8期2022-10-13
- 农杆菌转化法中的“Ti质粒转化载体系统”的简介
——一道江苏高考题的奥秘解读和拓展
用转移法，将重组质粒转入农杆菌，再与Ti质粒重组为共整合载体，然后转化植物细胞。共整合载体是农杆菌转化法中Ti质粒转化载体系统中的一种。这与高中教材介绍的农杆菌转化法不一样，人教版高中教材介绍的农杆菌转化法是将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T－DNA中构成重组质粒，再将重组质粒导入农杆菌，通过农杆菌的转化作用，将目的基因插入到植物细胞染色体DNA中，其过程如图2所示。图2 人教版教材中所示的农杆菌转化法高中教材介绍的仅是农杆菌转化法的思路，并不是具体操作步
中学生物学 2022年7期2022-09-07
- 全基因组测序后质粒的组装与鉴定研究进展*
的方法无法获得的质粒可由WGS数据进行组装，但组装质粒的正确性和完整性需要进一步鉴定和分析。从WGS中准确识别染色体序列和质粒序列是质粒鉴定分析的先决条件[6]。WGS可获得高质量的质粒序列，但很多组装质粒并不一定真实存在，质粒的组装仍存在较多问题，且尚未被解决，需改良WGS后的组装。本文对WGS技术的发展、WGS后质粒的组装、质粒的鉴定及质粒组装中存在的问题进行综述。1 WGS的发展第一代测序技术以Sanger等[1]提出的链终止法及Maxam等[7]提
成都医学院学报 2022年4期2022-08-19
- 质粒介导的印第安纳沙门氏菌耐药机制及分子溯源研究
也可以存在于细菌质粒上。质粒是在多数G-细菌中广泛存在的一种染色体外的遗传因子，质粒特性使细菌更易获得抗生素耐药性、增强细菌的致病性、代谢能力等多种特性[4]，并具增强细菌耐药基因传播能力。耐药I类整合子、转座子Tn3、TnsA、插入序列IS26、IS91作为细菌中存在的重要可移动元件，可对外源基因进行捕获和表达(尤其是存在于质粒上的整合子及移动元件)[5-6]。盛焕精等[7]通过质粒接合的实验说明菌株携带的质粒类型和相应的耐药表型存在关联，并且耐药基因可
中国人兽共患病学报 2022年7期2022-08-11
- 粪肠球菌内源性质粒的序列分析及其穿梭载体的构建
点[7−11]。质粒是细菌细胞中染色体之外，能够自主复制的共价闭合环状双螺旋的DNA分子或遗传因子。已有研究表明，乳酸菌可携带数个质粒，大小不一，其中多数质粒为隐蔽性质粒，少数质粒则具有某些特殊功能[12]。乳酸菌的一些特性与其所携带的质粒相关，并且这些特性可以通过质粒稳定转移至其他乳酸菌或其他细菌中[13]。目前已有许多研究对乳酸菌内源性质粒进行序列测定和功能分析，并利用乳酸菌内源性质粒上重要元件构建乳酸菌载体，其中获得乳酸菌内源性质粒的复制子是构建乳酸
食品工业科技 2021年23期2021-12-16
- 一种优化的提高质粒产量的提取方法
130021)质粒(plasmid)是广泛存在于生物界的环状双链DNA分子[1]。质粒DNA作为最基本的基因载体工具，在分子生物学、生物化学与细胞生物学等学科中得到广泛的应用[2]。质粒载体含有3个共同的结构：复制子，选择性标志和克隆位点，它们在质粒的表达与复制中发挥重要作用[3]。人们通过在质粒中插入目的基因，构建重组质粒，使目的基因在动物模型中表达，可以研究动物的生长发育、疾病发生等情况，如P53基因在犬乳腺恶性肿瘤中高表达[4]，VIPR-1基因在
畜牧与兽医 2021年11期2021-11-11
- 转录因子E2F1 及其突变体真核表达质粒的构建及稳定表达细胞株的建立
建了真核细胞表达质粒pFlag-E2F1 及其DNA 结合功能域突变体质粒pFlag-E2F1E132，并进一步获得了与之对应的稳筛细胞株。这些细胞株对E2F1 的关键下游靶基因的筛选具有重要意义。1 材料与方法1.1 材料HeLa 细胞和pFlag 真核细胞表达载体由天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室提供；pCMV-E2F1 表达质粒由中国科学院水生生物研究所生物多样性与水生生物保护重点实验室馈赠。1.2 试剂与仪器胎牛血清、DMEM细胞培养基，B
生物化工 2021年3期2021-07-10
- 生殖道衣原体质粒功能的研究进展
要的毒力物质——质粒[5]。质粒除了与衣原体的毒力和致病性有关外，还对衣原体自身生长代谢、诱导机体免疫应答作用均具有影响。本文对生殖道衣原体质粒的主要功能及其潜在应用价值作一概述。1 衣原体质粒的基本特征质粒是细菌中除染色体DNA外能自主复制的DNA分子。衣原体的质粒为环状双链DNA，大小约为7.5 kb，存在于染色体外，质粒在衣原体RB二分裂阶段能达到最多拷贝数，以便将质粒有效分配于子代衣原体中[6]。生殖道衣原体为非接合性质粒，不编码衣原体抗生素耐药性
中南医学科学杂志 2021年3期2021-06-02
- 单增李斯特菌质粒研究进展
力，单增李斯特菌质粒与其抗逆性有关。质粒是细菌染色体外具有遗传功能的DNA，非细菌生长代谢的必需元件，在辅助宿主菌的生存和适应中发挥重要作用。质粒可介导细菌间遗传物质的转移，使受体菌获得供体菌的选择性优势，如抗逆性、毒力、耐药等。上世纪80年代，Perez-Diaz等[3]首次报道了单增李斯特菌质粒，后来的研究发现质粒在单增李斯特菌中分布广泛，并发挥一定的生物学功能。本文将对单增李斯特菌质粒的分类、分布以及生物学特性等研究进展进行概述。1 单增李斯特菌质粒
中国人兽共患病学报 2021年4期2021-05-06
- mcr-1阳性类噬菌体质粒与F33∶A-∶B-质粒共整合形成的融合质粒的生物学特性分析
3∶A-∶B-型质粒是多重耐药质粒IncF型质粒中最为流行的亚型之一,它广泛存在于肠杆菌科细菌,尤其是大肠杆菌中,是介导fosA3、blaCTX-Ms和rmtB等耐药基因快速传播的主要载体[1-3]。F33∶A-∶B-型质粒除了能够借助IS26和IS1294元件捕获和传播抗性基因外,还能够获得IncN1、IncI1、IncR和IncX1型质粒的一些片段成为多复制子质粒[3]。本课题组在研究猪源大肠杆菌中mcr-1的水平转移能力时,首次发现在接合过程中,F3
江西农业学报 2021年4期2021-04-20
- 多变鱼腥藻ATCC 29413基因的一步插入失活
转移系统中的辅助质粒pRL623上缺少甲基化酶M.AvrⅡ基因,可能与难以构建多变鱼腥藻突变株有关[12,13]。为了克服藻株的限制酶对外源DNA的破坏,本研究克隆了该藻株自身的两个甲基化酶基因,构建了新的辅助质粒。利用该质粒对多变鱼腥藻ATCC 29413两个基因进行了插入失活,均实现了一步获得同源双交换子,比通常在丝状蓝藻敲除基因节省一半时间。1 材料与方法1.1 藻种、菌种及培养方法多变鱼腥藻ATCC 29413高温衍生株由美国南达科塔州州立大学周阮
水生生物学报 2021年1期2021-02-04
- 103个mcr质粒的结构与特征
检测到一种新的由质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1[8]。携带mcr-1基因的质粒具有接合转移能力，有助于黏菌素耐药性稳定持久的传播。随后，许多国家陆续报道了携带mcr-1基因质粒的革兰氏阴性菌，这些菌对公众健康造成了重大威胁[10-16]。目前质粒的报道主要集中在质粒草图水平上，侧重于mcr基因的基因环境分析，质粒的完成图报道占比相对较少[17]。近年来，黏菌素在畜禽养殖中作为促生长药物被禁用[18]，动物源细菌对黏菌素的耐药率随之持续下降，但是耐药率仍
浙江农业学报 2021年1期2021-01-28
- IncI1和IncN质粒阳性沙门氏菌耐药及质粒接合转移特征
危害[6-7]。质粒是独立于染色体外、可自主复制、通常携带多种抗性和毒力基因的闭合环状双链DNA，质粒的存在可使宿主菌产生耐药性和致病性等附加特性[8]。其中，接合质粒是一种与耐药基因水平传递和细菌耐药性获得的重要可移动元件[9]。在众多质粒中，IncI1型质粒有助于blaCTX-M-1基因在禽类和人之间散播[10]，IncN型质粒已被欧洲多个国家的研究者报道携带blaCTX-M-1基因[11-12]。此外，研究还发现IncI1质粒有时还可与IncN质粒共
食品科学 2020年18期2020-09-17
- 优化大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用
不同之处前者是单质粒编辑系统，后者是双质粒编辑系统。单质粒编辑系统[10]将Cas9，gRNA和供体DNA构建在同一个表达载体上，在遗传操作过程中，只需一轮质粒转化就能实现对基因组的编辑。但单质粒由于本身骨架片段较大，可插入的供体DNA大小受限，质粒构建会有一定的难度。双质粒编辑系统可以解决单质粒构建困难的问题，将Cas9，Red构建在一个质粒上，将目标N20-gRNA, 供体DNA片段构建在另一个质粒上，利用这个双质粒CRISPR/Cas9系统，大肠杆菌
生物学杂志 2020年4期2020-08-19
- 开发新方法追踪植物病害的全球传播（2020.6.7 iPlants）
质粒是可自主复制的非必需DNA分子，可加速许多重要的细菌的进化。例如，质粒传播抗生素抗性基因，这是人类和动物健康的紧迫问题。农杆菌获得致瘤的Ti质粒或根诱导（Ri）质粒后，将其转变为能够遗传转化并引起多种植物疾病的病原体。因此，对质粒进行进化关系分类，准确评估质粒对疾病暴发的影响，制定缓解疾病的策略以及加快利用质粒多样性进行生物技术研究的基础。但是，之前认为质粒过于多样化且能平行转移，导致无法分类。2020年6月6日，Science杂志在线发表了美国俄勒冈
三农资讯半月报 2020年11期2020-06-21
- 嗜水气单胞菌穿梭质粒载体p BKPU01的构建、表达和鉴定
要原因是含有多种质粒［4］。本实验室从嗜水气单胞菌中分离得到一种质粒，命名为质粒pBK760，该质粒具有多种位点和抗性，具有良好的载体特征。pMD20是一种高效克隆PCR产物的专用载体［5］。该载体以pUC19载体为基础，在其多克隆位点处的Xba I和BamH I位点之间增加了Spe I，Nde I，EcoRV3种酶切位点，经EcoR V酶切后再在两侧的3’端添加“T”制备而成［6］。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’端添加一
江苏科技信息 2020年1期2020-03-18
- 植物乳杆菌内源性质粒序列分析及其表达载体的构建
酸杆菌携带有数个质粒，大小不一，其中多数质粒为隐蔽性质粒，少数质粒具有某些特殊功能[7]。目前，已有许多乳杆菌质粒被测序，并用于构建质粒载体，如副干酪乳杆菌的质粒pCD01和pCD02[8]、干酪乳杆菌的质粒pLC494[9]和pMC11[10]、植物乳杆菌质粒pD403[11]和pM4[12]等。乳酸杆菌质粒复制方式为滚环复制和θ复制，通常较小的质粒（＜12 kb）通过滚环方式进行复制[13]。通过对乳酸菌质粒的测序、分析，得到乳酸菌质粒的复制子是构建质
食品科学 2020年4期2020-03-11
- 以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用
]，即选择合适的质粒，将靶基因两侧的同源序列克隆至载体上，转入宿主菌后通过同源重组实现对靶基因的置换敲除。由于微生物的多样性，将外源DNA导入宿主菌并完成同源重组的策略也千差万别。目前，未见有适合于多种宿主菌基因敲除的通用重组系统的报道。因此，需要根据宿主菌的特点来构建相对特异的基因敲除系统，用于基因功能研究。葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)是引起医院内感染的重要病原菌[3-5]，由于其GC含量较低(mol%约28%～35%)，通过同源重
中国人兽共患病学报 2019年7期2019-08-07
- 微滴数字PCR检测含有目的基因的PUC57质粒问题分析
7]。PUC57质粒是大肠杆菌载体含有2 710 bp。本实验利用ddPCR检测含有目的基因的PUC57质粒，对检测过程中出现的酶切、酶切孵育时间和酶切后放置天数的问题进行了探讨，为同行提供参考。1 材料与方法1.1材料 根据GenBank中乙肝病毒DNA(HBV DNA)的序列，经过序列比对分析，针对HBV DNA保守区设计引物和探针，用引物扩增的那段目的基因片段(95 bp)构建PUC57质粒，质粒的构建由上海生工生物工程有限公司完成。质粒含有2 80
国际检验医学杂志 2019年6期2019-03-26
- 中草药对细菌耐药质粒的消除作用研究
药性能够通过耐药质粒介导，由一种微生物转移到另一种微生物［2-3］；此外，耐药质粒携带的多种耐药标记，也可经由菌株间的接合而相互传递［4］，从而引起细菌对新的抗生素药物产生耐药性，最终导致菌株的多重耐药性和多重耐药菌株的出现［5］，这促使研究者加快研究耐药性质粒消除的步伐。大肠杆菌等耐药菌株在临床上有逐年增多的趋势，且耐药性变迁的速度极快，另外，该菌的生长、繁殖速度快，耐药质粒复制时能够随着遗传物质复制，使交叉耐药菌株不断出现，耐药谱变宽。因此，要使细菌性
中国兽药杂志 2018年11期2018-12-15
- 猪带绦虫TSOL18基因重组乳球菌疫苗的稳定性分析
拟将猪带绦虫重组质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18电穿孔转化入L.lactisMG1363，分别在无红霉素抗性和含红霉素抗性条件下连续人工传代20次，通过测定质粒稳定率和SacI/HindIII双酶切鉴定，测定质粒pMG36e-TSOL18、pMG36e-SP-TSOL18在L.lactis中的遗传稳定性。1 材料与方法1.1 材料1.1.1质粒与菌种 重组质粒pMG36e-TSOL18和pMG36e-SP-TSOL18、由本
中国人兽共患病学报 2018年11期2018-12-13
- 植物乳杆菌野生质粒分析及其提取方法的优化
存在大量的野生型质粒，能够表达和遗传如代谢、抗性相关的基因，因此，挖掘高拷贝、稳定复制的野生型质粒元件和无质粒受体菌是构建细菌表达系统的关键［4］。由于乳酸菌为革兰氏阳性菌，且部分野生型质粒拷贝数低，因此使用传统碱裂解法或普通质粒提取试剂盒提取效果并不理想［4-5］。目前，乳酸菌质粒提取方法已有多个报道，但操作均过于复杂、周期长、毒性大、质粒产量低且多数只适合对数期乳酸球菌［6-9］，因此，该试验对比研究已报道的两种常规方法和优化后的方法，最终得到可应用于
畜牧与饲料科学 2018年11期2018-12-10
- 沉默结肠癌转移相关基因KPNA2对卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭和顺铂敏感性的影响及其机制
gfp-s3重组质粒以及空质粒pSUPER-Egfp-neo购于上海北诺生物科技有限公司；兔抗人KPNA2单克隆抗体、兔抗人Erk1/2和p-Erk1/2多克隆抗体、兔抗人Caspase-3、活化后Caspase-3单克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；ECL显色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、Transwell小室购于北京科宇深蓝科技有限公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养、分组与转染 CAOV3细胞放入含10%胎牛血清的DMEM培养液中，CO2孵箱
山东医药 2018年35期2018-10-26
- 大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌高效穿梭质粒pFY02的构建和应用
失基因克隆至穿梭质粒进行功能回补验证。在我们之前的研究中，构建了能够用于鸭疫里默氏杆菌基因回补的穿梭质粒pLMF03[15]，然而该质粒所包含酶切位点较少，接合转移效率低下，不能满足所有鸭疫里默氏杆菌基因的回补。为解决这一缺陷，本研究构建了结合转移效率高，能稳定存在于鸭疫里默氏杆菌中且能用于鸭疫里默氏杆菌基因回补的穿梭质粒pFY02。1 材料与方法1.1 菌株及试剂质粒 pPM5由比利时那慕尔大学 Guy R.Cornelis教授惠赠[16]。质粒 pEX
生物工程学报 2018年10期2018-10-25
- 短乳杆菌天然质粒分类
个短乳杆菌天然质粒基因组序列，从质粒大小、数量和复制类型而言，短乳杆菌是乳杆菌属中携带天然质粒最丰富的菌种之一[7]，这一现象表明，质粒在短乳杆菌生长、代谢、遗传和进化等生物学过程中可能扮演着特殊且重要的角色，此外，众多天然质粒的发现和测定为短乳杆菌基因工程改造和生物技术应用提供了必要的研究和材料基础。然而，目前对短乳杆菌天然质粒的了解和研究比较有限，现有研究主要集中于载体构建[8-10]和特殊功能质粒[11-12]。本研究以短乳杆菌天然质粒为研究对象，
食品科学 2018年10期2018-05-23
- 一株食窦魏斯氏菌的分离鉴定及其质粒的序列分析
功能都与其携带的质粒相关,如产胞外多糖、产细菌素、抗生素抗性等[9]。因此对质粒生物学和遗传学的研究受到了极大关注。许多魏斯氏菌拥有一个或多个天然质粒,但是相对于乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属等质粒,对魏斯氏菌质粒研究较少[9-10]。Park[11]、金红星[12]、Kim[13]等分别从食窦魏斯氏菌(Weissellacibaria)分别分离出3、2、6个质粒,王海娟等[14]从融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)中分离出了2个质粒,并对部分
食品工业科技 2018年8期2018-05-01
- 质粒DNA的转化、提取及酶切分析
●黄静质粒DNA的转化、提取及酶切分析●黄静目的：构建人Bcl-2基因原核表达载体，并对其酶切鉴定。方法：将Bcl-2重组质粒转化进入经CaCl2法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选培养充分克隆，然后用碱裂解法分离提取重组质粒DNA，最后用限制性内切酶酶切重组质粒DNA，并跑电泳鉴定。人Bcl-2基因；质粒转化；CaCl2法；质粒提取；碱裂解法；酶切分析本研究介绍人Bcl-2重组质粒DNA的转化、分离提取和内切酶酶切鉴定。1 材料与方法1.1 试剂不含
保健文汇 2017年6期2017-11-02
- 基于模型建构的“基因工程”一节的高三复习教学设计
步骤，形成正确的质粒选择策略、限制酶选择策略、质粒标记基因的运用策略，理解3种受体细胞的产生。2.2 过程与方法目标 经历模拟活动，理解基因工程中的一些操作策略；参与探究活动，体验科学发现、形成结论的过程；提高自主学习和合作探究的能力。2.3 情感态度与价值观目标 感受合作探究的乐趣，培养实事求是的精神。3 教学过程3.1 课前活动——基因工程中的“剪”和“粘”的练习准备小组活动材料：DNA分子3个(图1，纸质，长度为A4纸高)，阴影部分示限制酶识别序列，
生物学教学 2017年3期2017-08-20
- 细菌中获得并转移耐药基因—质粒概述
并转移耐药基因—质粒概述高淑娟 （山东省泰安市岱岳区畜牧兽医局 271000）细菌已在地球上存在了30亿年左右，变得擅于保护自己免受有毒化学物质的侵害。而抗生素在临床上使用已有70多年，目前耐药性问题成为了世界上严峻的问题之一，同时这也证明了细菌适应能力之强及传播速度之快。细菌的耐药性机制有多种方式，包括：靶点保护，靶点替代，抗生素降解以及阻断胞内抗生素积累。耐药性的获得是在多种基因转移系统协助下完成的，耐药基因转移系统(如细菌接合质粒，转座元件和整合子系
山东畜牧兽医 2017年9期2017-04-05
- 一个融合魏斯氏菌隐蔽质粒的序列分析
融合魏斯氏菌隐蔽质粒的序列分析王海娟1戴雨珂2苏森森1王英3潘渠1（1. 成都医学院病原生物学教研室，成都 610500；2. 成都医学院公共卫生系，成都 610500；3. 成都军区总医院肾内科，成都 610500）从融合魏斯氏菌（Weissella confusa QJ012）中发现一个隐蔽质粒（pQJ012），测序结果显示该质粒大小为1 489 bp，碱基G+C含量为42.8%。BLAST结果显示该质粒的核苷酸序列同pJY33和pKLCA的同源性分别
生物技术通报 2016年4期2016-06-13
- 质粒抽提策略对双酶切鉴定的影响
2］，而很少报道质粒抽提策略对弥散的影响。笔者在双酶切鉴定葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD)重组质粒pET-28a-G6PD时，发现质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散有显著影响，现报道如下，以供参考。1 材料与方法1.1 质粒与菌株含空质粒 pET-28a的大肠杆菌 Top10(pET-28a/Top10)由本教研室保存。重组质粒pET-28a-G6PD为笔者构建并转化至Top10感受
山西医科大学学报 2015年6期2015-12-16
- 产丙酮酸氧化酶重组大肠杆菌的发酵过程质粒稳定性研究
菌的发酵过程中，质粒不稳定性（Plasmid instability）是一个比较严重的问题，会导致目的产物水平的下降.在工业发酵过程中，对重组细胞要求质粒稳定性保持在25代以上[11].因此，研究重组细胞质粒的稳定性对于提高发酵效率有着十分重要的意义[12].从目前已有报道来看，影响质粒稳定性的因素很多，比如生长培养基组分[13-14]、质粒拷贝数[15]、宿主遗传背景、培养条件、比生长速率[16]、培养温度[17]、外源蛋白表达水平[18]以及所表达蛋白
常熟理工学院学报 2015年4期2015-06-15
- 携带SLC基因的Birc5－siRNA质粒载体的构建及鉴定＊
c5－siRNA质粒载体的构建及鉴定＊舒 榕1，王 强2△，朱慧芬3，孙媛丽3，贺 琪3， 万京华21湖北省中山医院麻醉科，武汉 4300332武汉科技大学医学院基础医学院病原生物与免疫学系，武汉 4300653华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系，武汉 430030目的 构建携带SLC基因的Birc5－siRNA质粒载体，为肿瘤靶向治疗研究提供基础。方法 使用Ambion公司siRNATarget Finder设计的Birc5mRNA干扰序列，将Bi
华中科技大学学报（医学版） 2015年1期2015-06-05
- 乳杆菌属天然质粒研究进展
曦*乳杆菌属天然质粒研究进展孙大庆1,2，李洪飞1，宋大巍1，杨 健1,3，张东杰1,3，许晓曦2,*（1.黑龙江八一农垦大学 国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319）天然质粒在乳杆菌属多个菌种中已被发现，它们携带了许多重要生理功能和胁迫因子抗性基因，对乳杆菌遗传、代谢、进化等生物学研究具有重要意义。本文概述乳杆菌属天然质粒的生
食品科学 2015年11期2015-04-09
- 抗鼻咽癌质粒pFY转化和菌种筛选的研究*
基础研究抗鼻咽癌质粒pFY转化和菌种筛选的研究*翁闪凡，刘 娜，张晓林(佛山科学技术学院医学院医学检验系，广东佛山 528000)目的筛选携带抗鼻咽癌质粒pFY的稳定高产菌株。方法以CaCl2法制备大肠杆菌JM109感受态，将抗鼻咽癌质粒pFY转化JM109感受态，对琼脂平板上获得的菌落进行筛选，选出符合标准的单菌落为菌种，进行菌种稳定性实验。用质粒提取试剂盒检测质粒含量。将抗鼻咽癌质粒pFY转染到细胞CNE-2中，四氮唑蓝(MTT)比色法观察转染试剂及质
重庆医学 2015年26期2015-01-06
- 乳制品乳酸菌遗传学概述*
储存于自主复制的质粒中。乳酸菌遗传学研究的主要是它们当中的质粒和噬菌体，这些质粒和噬菌体在乳酸菌中起着比较重要的作用，对比染色体，采用分子遗传分析方法来分析的质粒和噬菌体更加容易获取和研究。众所周知，好的发酵剂菌株对于乳制品发酵来说至关重要，但是这些菌株的某些特性并不稳定，而大部分原因归咎于质粒的缺失，质粒的编码消除等对菌株的特性至关重要。1.1 质粒DNA的检测及其丰度1972年，Mckay等人［4］推断乳酸链球菌(Str.lactis)丧失利用乳糖的能
食品与发酵工业 2014年1期2014-12-16
- GM-CSF 与生长抑素共表达基因疫苗的构建和鉴定
等以猪的真核表达质粒pGM-CSF 为模板，构建GM-CSF 与SS 融合表达质粒(pGM-CSF/SS)，免疫小鼠后，可增强小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力，提高生长抑素抗体的P/N 值［2］，提高肌肉组织中GHR 和IGF-I mRNA 的表达［3］。本研究利用动物的生长轴的原理，采用生物工程的方法，应用共表达载体pIRES 将GM-CSF 基因和SS 基因分别克隆到载体的多克隆位点A 和B，构建共表达基因疫苗，旨在同时表达GM-CSF 和SS 两种蛋白，研
江西农业大学学报 2014年5期2014-12-14
- 萤光素酶表达质粒pEE14.1-luc的构建及表达
探讨[4]，其中质粒的大小是影响递送效率的重要因素之一。现有含萤光素酶报告基因的质粒pGL3-CMV，但分子较小仅为5 kb，不便于模拟分子较大的DNA 质粒进行电穿孔递送条件的研究[5]。因此，我们构建了萤光素酶表达质粒pEE14.1-luc，其中pEE14.1 是一种高效表达载体[6]，分子较大约为11 kb，将萤光素酶报告基因luc克隆入该载体后的质粒分子可达12.7 kb。以此质粒作为大分子质粒的代表，为进一步摸索递送10 kb 以上质粒的电穿孔条
生物技术通讯 2014年6期2014-11-29
- 优化的密度梯度离心法提取质粒DNA
050024)质粒DNA是一种基因运载工具，在分子生物学、基因工程中有着极为广泛的应用，作为质粒载体有3个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点.而质粒 DNA 的分离提取是分子生物学实验中最基本的工作.现在已经建立了多种提取纯化质粒 DNA的方法[1]，这些方法都包括 3个步骤：培养细菌，收集和裂解细菌，纯化质粒DNA.由于质粒的大小不同，收集质粒的方法应有所区别，大于15 kb的质粒要用温和的方法.小于15 kb的质粒可以用较剧烈的方法
衡水学院学报 2014年4期2014-11-23
- Bach1克隆构建及其对肝癌细胞药物敏感性的影响
li.DH5α、质粒pBI-EGFP、质粒pTet-Off、人肝癌细胞系SMMC-7721：本室保存；质粒pQE30-Bach1：美国教授馈赠；限制性核酸内切酶NheⅠ，MluⅠ，KpnⅠ，HindⅢ：Fermentas公司；PCR产物纯化试剂盒：上海捷瑞生物工程股份有限公司；RPMI1640培养基：Gibco公司； 无支原体胎牛血清：北京索来宝公司；脂质体2000转染试剂：Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒：华北制药集团有限公司。1.2重
中国老年学杂志 2014年21期2014-09-13
- 细菌线性质粒的复制研究
212013）质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，广泛存在于许多生物中，习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA 分子，它们能为宿主提供一些额外的功能，如抗药性和毒力等，绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子。1979 年，在产抗生素的土壤微生物——娄彻链霉菌中发现了第一例原核生物线性质粒［1］，到目前为止，已在数十种链霉菌中发现了线性质粒，其分子大小在12-640 kb 之间［2］。1985 年，在疏螺旋体中发现了另一大类
生物技术通报 2014年5期2014-04-10
- 大肠杆菌外源蛋白表达载体稳定性的研究进展
610041）质粒稳定性是影响基因工程菌外源蛋白表达的重要因素，同时外源蛋白的表达又影响质粒的稳定性。随着DNA 重组技术的发展，该技术在科研工作和应用生产中占据着越来越重要的位置。目前，关于质粒稳定性及其改良的论述仍比较少见，且不够全面。自20 世纪70 年代以来，大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。大肠杆菌遗传背景清楚，转化和转导效率高，成本低廉，生长繁殖快，结构简单，培养操作简便，可以大规模地快速生产目的蛋白，加之其表达外源基因产物的水
生物技术通报 2014年5期2014-01-14
- Chelex－100法提取真核表达质粒pcDNA3－HERG的应用体会
0法提取真核表达质粒pcDNA3－HERG的应用体会杨海涛目的 探讨Chelex－100法提取先天性长QT综合征相关人类真核表达质粒pcDNA3－HERG的可行性。方法 分别用Chelex－100法和碱裂解法提取pcDNA3－HERG质粒，将环状质性DNA酶切为线性，0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测质粒提取的有效性。结果 用Chelex－100法和碱裂解法提取的pcDNA3－HERG质粒的OD(A260/A280)比较差异无统计学意义［分别为(1.8±
中国医学创新 2012年6期2012-11-15
- 卡介苗穿梭表达质粒p MS MCP－1的构建与鉴定＊
，将构建穿梭表达质粒，欲将该质粒导入BCG，使BCG表达分泌MCP－1，达到构建重组BCG的目的。1 材料和方法1.1 材料 Taq DNA 聚合酶、Eco RⅠ、SaⅡ、Bam HⅠ、T4DNA连接酶、DNA Marker DL2000、Marker DL15000购于上海皓嘉科技发展有限公司。BCG上海丹麦株由上海市生物制品研究所惠赠。质粒p M V261（Stover CK博士构建）由四川大学生命科学学院徐恒教授惠赠 。人MCP－1c DNA由上海交
医学理论与实践 2012年20期2012-09-11
- 结核分枝杆菌Rpf－DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究
pf E－DNA质粒疫苗的构建和表达：具体方法参考文献［4］。2．转染质粒制备：按照梭华Sofast基因转染试剂盒操作说明书制备。3．免疫动物：180只SPF级4周龄BALB／c雌性小鼠，平均分为6组。即空质粒组、Rpf D质粒组、Rpf E质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组。空质粒组、Rpf D质粒组、Rpf E质粒组和生理盐水组分别背部皮下接种空质粒转染质粒、Rpf D－DNA转染质粒、Rpf E－DNA转染质粒、生理盐水各200μl；而空白对照
中国防痨杂志 2012年8期2012-09-02
- 经典碱裂解法质粒大量提取方法的改良
高浓度及高纯度的质粒DNA，且要求DNA的A260/A280值应控制在1.8～2.0之间。虽然近些年来质粒大量提取试剂盒层出不穷，但大多费用较高，所以目前大多实验室仍以传统的手提方法为主，其中以萨姆布鲁克[1]提出的经典碱裂解法应用的最为广泛。但此方法却仍存在诸多弊端，例如操作复杂、耗时、所得质粒纯度低等，尤其是多次使用有机溶剂容易造成质粒DNA的污染，且易对实验人员构成危害，实验废液也会造成不同程度的环境污染[2]。因此本实验室在经典的碱裂解法基础上，采
黑龙江八一农垦大学学报 2012年2期2012-07-04
- 不同转染条件影响质粒转染效率的探讨
不同转染条件影响质粒转染效率的探讨王红钢1，林 波2，汪文利3（1.河南大学医学院 生物化学与分子生物学教研室，河南 开封 475004；2.河南大学医学院 病理生理学教研室，河南 开封 475004；3.开封市第二人民医院 耳鼻喉科，河南 开封 475000）目的通过插入不同片段质粒、不同剂量的转染，研究GFP基因转染效率的变化。方法构建插入不同片段的载体，以不同条件转染HeLa细胞，以Northern blot分别检测转染入细胞中各个质粒的表达水平。结
河南大学学报（医学版） 2012年2期2012-04-06
- 聚乙二醇修饰多壁碳纳米管对质粒DNA的影响
修饰MWNTs与质粒DNA的作用情况，并从二者对质粒DNA损伤的角度考察了MWNTs的生物相容性.1 实验本实验中使用的MWNTs直径为10～30 nm，长度为5～50 μm，购自深圳市纳米港公司.本实验采用混酸氧化法纯化MWNTs，用V(浓硝酸)∶V(浓硫酸)=1∶3的混合酸超声处理MWNTs，通过离心分离和真空干燥，得到的黑色固体为纯化MWNTs.PEG修饰MWNTs的合成方法为如下：取干燥的50 mg纯化MWNTs，加入15 mL pH=7.0的磷酸
上海大学学报（自然科学版） 2011年3期2011-01-31
- 大肠杆菌hCG核酸疫苗质粒扩增营养条件研究
基因构建真核表达质粒直接导入动物体细胞内，使外源基因通过机体内源性表达系统并提呈给免疫系统，诱发产生特异性免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。由于质粒DNA传递系统转染细胞的效率比较低，估计提供给细胞的每1000个质粒分子只有1个能到达细胞核并被表达，导致彻底治愈疾病需要大量的质粒DNA,因此，随着核酸疫苗进入临床研究，必须开发质粒DNA的大规模生产技术。质粒DNA生产的工艺流程包括质粒DNA的构建、工程菌发酵、菌体收集、细菌裂解、纯化浓缩、质量检验与包
化学与生物工程 2010年1期2010-06-04