3种防御酶在水稻抗稻曲病中的活性变化

李小娟, 刘二明*, 谭小平, 肖启明, 刘年喜, 王金辉

(1.湖南农业大学生物安全科学技术学院,长沙 410128;2.湖南省植保植检站,长沙 410005)

水稻稻曲病(false smut of rice)又叫假黑穗病、绿黑穗病、黑球病、青粉病和丰收病,是水稻穗部的真菌性病害,其病原菌的无性阶段为有丝分裂孢子真菌稻绿核菌[Ustilaginoidea virens(Cke)Tak],有性世代为子囊菌中的稻麦角菌(Claviceps oryzaesativae Hashiok)。该病害在世界产稻区都有发生[1],目前呈加重趋势,它不仅降低水稻产量,严重影响稻米品质[2],而且产生的稻曲病菌毒素,对人、畜有毒,影响人、畜健康[3-4]。

目前对稻曲球的组织生化研究很少,与抗稻曲病相关的生化机制也未见系统的研究。代光辉等[5]报道,抗感病品种中都存在过氧化物酶和木栓质,而且差异不大,可能与抗病性无关;木质素和多酚类物质在抗、感2个品种中也都存在,且抗病品种中的含量明显多于感病品种。木质素和多酚类物质可能在抗病中起着某种作用,有可能作为筛选抗病品种的一个指标。代光辉等观察显示,在稻曲球中存在能发出荧光的“蝴蝶”型结构,稻曲球内不含过氧化物酶、木栓质、木质素和单宁类物质。苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等防御酶在其他作物病害中对抗病性的影响有较多的报道[6-9]。

本试验用稻曲病菌分生孢子接种不同抗、感病的水稻品种,测定水稻3种酶活性的变化情况,期望从有关酶的生化测定找到与抗病性相关的指标,为抗性鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试品种

在温室内栽培12个抗感程度不同的水稻品种,用直径20 cm、高35 cm的灰塑料桶栽培,每桶栽3株,3次重复。这些供试品种在田间抗性表现从感病到抗病依次为:红莲优6号、两优培九、Ⅱ优58、Ⅱ优 416、新香优 207、汕优 46、威优 207、特优111、金优 191、汕优 63、K 优 817、威优 46。

1.2 接种体的培养

将分离得到的稻曲病菌厚垣孢子挑取到装100 mL马铃薯蔗糖(PS)培养液的三角瓶中,在水平摇床上26℃黑暗条件下130 r/min振荡培养7 d,产生的分生孢子用于接种,浓度为100×视野下200个孢子。

1.3 接种时期与方法

在水稻孕穗末期即破口前3～7 d,用注射器将接种体注射到水稻穗部。接种后温室内用加湿器加湿,温度控制为28℃。

1.4 取样

分别在水稻孕穗末期接种前、接种后 1、3、5、7 d,剪取接种部位进行酶的活性测定。

1.5 与抗性相关的生化指标的测定方法

1.5.1 PAL活性的测定

参照Meyer等[10]的方法。称取待测定材料各1 g,加入 10 mL预冷的酶提取缓冲液(含1 mmol/L EDTA、20 mmol/Lβ-巯 基乙醇和 1%PVP 的0.1 mol/L pH 8.7的PBS)匀浆,4 ℃、10 000 r/min离心20 min。上清液即为酶粗提液。取2.5 mL酶提取液,加50μL 0.6 mmol/L L-苯丙氨酸、100μL 0.1 mol/L p H 8.7的PBS,40℃保温60 min,加入0.2 mL 2 mol/L的 HCl终止反应,测290 nm吸光值,以不加酶液的反应体系标定为 0,以ΔA290/(min·g)FW为一个酶活力单位。分别测定接种前 、接种后1、3、5、7 d 的抗病品种、感病品种和对照的A值,根据 A值,比较不同品种的苯丙氨酸解氨酶的活性情况。

1.5.2 POD活性的测定

参照Chance和Maehly[11]的方法进行测定,称取1 g取样材料,加入预冷的酶提取液10 mL(含1%PVP的 0.05 mol/L、p H 7.0的 PBS)匀浆,10 000r/min、4℃离心 20 min,上清为酶粗提液。在3 mL石英比色皿中加入2.8 mL过氧化物反应液(含0.015 mol/L H 2O2的 0.05 mol/L、p H 7.0的PBS)、0.2 mL过氧化物酶提取液,记其在240 nm的吸光值,测酶活,以不加酶液的反应体系标定为0,以ΔA240/(min·g)为一个酶活力单位。分别测定接种前、接种后 1、3、5、7 d各品种和对照的 A值,根据A值,比较抗病品种、感病品种及对照的过氧化物酶的活性变化情况。

1.5.3 PPO活性的测定

参照文献[12]的测定方法,称取1 g取样材料洗净、擦干并剪碎,加入8 mL冰冷的p H 5.6的柠檬酸-磷酸缓冲液,研磨成匀浆,4℃10 000 r/min离心15 min,上清液为酶提取液,取3.8 mL缓冲液,0.2 mL酶液,1 mL 0.1 mol/L的邻苯二酚,37℃反应30 min,立即用20%的三氯乙酸终止反应,以不加酶液的反应体系标定为0,离心后于420 nm测定其A值,以A值变化0.01为一个酶活性单位。分别测出接种前、接种后 1、3、5、7 d各品种和对照的A值,根据A值,比较抗病品种、感病品种及对照的多酚氧化酶的活性变化情况。

2 结果与分析

2.1 PAL的活性变化

试验结果如图1,接种前各品种相差不大,接种后第1天抗病品种威优46的PAL活性增加了10.5/(min·g),K优817增加了8.9/(min·g);感病品种红莲优6号接种1 d后酶活性稍有下降,感病品种两优培九酶活性也变化不大,以后几天的酶活性都呈下降趋势,且比接种前的还要低,但特优111、K优817、威优46要比接种前的稍高。在接种后1～3 d是酶的变化活跃期。

图1 12个水稻品种接种稻曲病菌后的PAL活性变化

结果表明接种后抗病品种比感病品种的PAL活性增加快,酶活高峰期要高。

2.2 POD的活性变化

接种后各品种的酶活性都呈上升趋势(图2),尤其是威优46、K优817,接种后第1天酶活性增幅较大,ΔA240分别增加了 9.6、7.3/(min·g);过了高峰期后酶活性又缓慢下降;感病品种两优培九、红莲优6号、特优111接种后酶活性变化不太明显,只是缓慢上升。结果表明,接种后抗病品种比感病品种POD的变化要快,酶活高峰期要高。

2.3 PPO的活性变化

如图3,接种前各品种的PPO活性相差不大,接种后第1天PPO活性达到最高峰,抗病品种威优46、K 优 817、汕优63增幅很大,ΔA420分别增加了0.062、0.056、0.055/(min ·μg),感病品种两优培九、红莲优6号PPO活性增加缓慢。

结果表明,接种后抗病品种比感病品种PPO增加的幅度大,酶活高峰期要高。

3 讨论

各水稻品种接种稻曲病分生孢子后,一些抗病品种如威优46、K优817的PAL、POD、PPO活性在接种后第1天达到最高峰,且变化幅度最大。一些感病品种如两优培九、红莲优 6号接种后PAL、POD、PPO活性变化不很明显,先有少许缓慢上升,然后慢慢下降。根据对12个抗感水平不同的品种接种后的PAL、POD、PPO活性的测定,可以看出抗病品种的这些酶活性在接种后迅速升高,变化幅度较大;而感病品种则比抗性品种的酶活性要低,接种后酶活性缓慢增加,有些甚至下降,变化幅度不明显。有些品种的酶活性变化不稳定,如金优191田间表现为抗病,但接种后PAL、POD活性变化缓慢,PPO活性变化幅度大,原因需进一步研究。本试验得出过氧化物酶与抗病性相关,与代光辉等[5]报道的可能无关不符;他报道的多酚类物质在抗、感2个品种中也都存在,且抗病品种中的含量明显多于感病品种,在本文中得到进一步的证实。

与抗性相关的一些其他生化指标如代光辉等[5]提到的木栓质、木质素和单宁类物质等有待以后进一步研究,以获得更好、更密切的与抗性相关的生化指标。

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