不同频率正弦波振动对大鼠废用性肌萎缩的对抗作用

石 磊，曹若男，樊小力，陈龙伟

●成果报告

不同频率正弦波振动对大鼠废用性肌萎缩的对抗作用

石 磊1，曹若男2，樊小力3，陈龙伟1

目的：探讨正弦波振动（HFV）对制动大鼠肌肉萎缩的对抗作用。方法：以大鼠后肢制动为废用模型，对振动组大鼠施以不同频率的HFV，观察大鼠比目鱼肌（SOL）湿重体重比、肌纤维横截面积、梭外肌纤维构成比以及梭内肌纤维肌球蛋白重链（MHC）的表达的变化。结果：（1）制动14 d后，SOL湿重体重比、肌纤维横截面积以及梭外肌Ⅰ型肌纤维的构成比明显下降，Ⅱ型肌纤维的构成比明显增加，梭内肌纤维MHC的表达有所增强；（2）施加HFV后，SOL湿重体重比、肌纤维横截面积和Ⅰ型肌纤维的构成比明显上升，Ⅱ型肌纤维的构成比明显下降，梭内肌纤维MHC的表达正常。结论：HFV可对抗废用后SOLⅠ型肌纤维向Ⅱ型肌纤维的转化和梭内肌MHC表达有增强的趋势，且以200 Hz HFV组最为显著。

高频正弦波振动；肌球蛋白重链；肌梭

运动减退、制动或肌肉去负荷，均可使骨骼肌出现明显的废用性萎缩[1-2]，肌纤维的重量及横截面积均发生明显改变，这种改变对人体的技能提高和恢复效率乃至运动寿命会产生深远的影响[3-6]。因此，随着我国体育事业的发展，寻找和制定更为安全有效的防护措施具有重要意义。

肌梭的传入放电减少是废用性肌萎缩发生的重要原因之一[7-8]。因此我们推论，如某种方法可以使肌梭的传入增强，则在理论上能够对抗废用性肌萎缩。研究表明，高频正弦波振动（HFV）可以选择性地兴奋肌梭[9-12]。为此，我们以大鼠后肢伸长位制动为废用动物模型，采用短时间歇式振动的方法，结合免疫组化染色法检测，观察50 Hz、200 Hz和400 Hz HFV对制动大鼠比目鱼肌（SOL）湿重体重比、肌纤维横截面积、梭外肌纤维的构成比以及梭内肌纤维MHC表达的影响，探讨其对废用性肌萎缩的对抗作用，为寻找预防和治疗废用性肌萎缩的有效措施提供资料。

1 研究对象与方法

1.1 实验动物及分组

将健康雌性Sprague-Dawley品系大鼠按体重配对原则分为5组（西安交大医学院实验动物中心提供，体重为230～240 g，每组7只动物）：正常同步对照组（CON），制动（IMM）14天组，制动+50 Hz振动（IMM+50 Hz HFV）14天组，制动+200 Hz振动（IMM+100 Hz HFV）14天组，制动+400 Hz振动（IMM+200 Hz HFV）14天组。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[13]。

1.2 制动动物模型

应用传统模型并加以改进[14]：将大鼠进行腹腔麻醉，在大鼠左后肢的弯曲部位（神经和血管较为密集且易受压位置）垫以棉层，最终用石膏绷带包扎动物后肢，将其固定在踝关节背伸（约45°）而膝关节伸展（约180°）位，使SOL处于伸长位。

1.3 振动方法

在SOL肌腹部位采取短时多次的间歇式振动方法进行振动（50 Hz、200 Hz和400 Hz，300 μm，14天）。振动刺激详尽环节如下：每振动1 min后间歇1 min，重复4次后间歇2 min，此为一个振动周期，一个振动点每周期振动时间总计4 min（不包括间歇时间），每次重复振动3个周期，每天进行4次振动。

1.4 MHC表达的免疫组化染色检测

将大鼠进行腹腔麻醉，称体重后经升主动脉行血管灌注固定。灌注后立即取出大鼠左下肢SOL，称重并剪修肌肉（以100 g体重标化计算比目鱼肌湿重体重比，MWW/BW），然后浸于多聚甲醛固定液（40 g/L，4℃）中过夜，以垂直位行石蜡包埋。石蜡切片以接近肌腹的横截面（厚度为5 μm）为优选。研究采取抗快缩型MHC抗体（一抗为MY－32，购自Sigma公司；二抗为抗小鼠IgG，购自Vector公司），参照传统ABC法进行免疫组化染色。

1.5 统计学分析

实验应用 Image－Pro PLUS图象分析系统（MEDIA CYBERNETICS）对各型肌纤维的细胞数进行定量分析，测定每个视野内各型肌纤维数，并计算各型肌纤维的构成比和肌纤维的横截面积（CSA），求出每组动物的均值。实验数据采用SPSS10.0软件中的单因素方差分析法（ANOVA）进行统计分析。实验结果以均数±标准差（±S）表示，取P＜0.05作为统计学差异的界值。

2结 果

2.1 HFV对制动大鼠梭外肌纤维MHC表达及显微结构的影响

大鼠行制动实验14天后，梭外肌快缩型MHC的表达与CON组相比有所增强，SOL肌纤维的构成比有明显改变，Ⅰ型肌纤维（慢肌）的构成比减少，由86%减少到70%，Ⅱ型肌纤维（快肌）的构成比增加，由14%增加到30%，IMM组I、II型肌纤维的平均横截面积以及比目鱼肌湿重体重比均有所下降，与CON组对比有显著性差异（P＜0.05）。这表明制动使SOL有了慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势。IMM组SOL梭外肌纤维结构特征：肌束状结构紊乱，肌纤维间隙加大，肌内膜下结缔组织大量增生，有呈病灶性表现的倾向。振动组与IMM组的染色结果相比，Ⅰ型肌纤维的构成比明显上升，同时Ⅱ型肌纤维的构成比明显下降（P＜0.05），其中以IMM+200 Hz HFV组的变化最为明显。振动组I、II型肌纤维的平均横截面积以及比目鱼肌湿重体重比与CON组对比均有所下降，但无显著性差异（P＞0.05，见表1）。结果提示，在制动期间对大鼠施加HFV可以对抗因制动而引起的梭外慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势。

表1 HFV对模拟废用大鼠SOL梭外肌纤维的对抗作用Tab.1 Effects of HFV on expression of MHC in ertrafusal fibers in soleus muscles of rats with immobilization（n=7，±S）

表1 HFV对模拟废用大鼠SOL梭外肌纤维的对抗作用Tab.1 Effects of HFV on expression of MHC in ertrafusal fibers in soleus muscles of rats with immobilization（n=7，±S）

注：*P＜0.05，与CON组相比；#P＜0.05，与IMM相比。

组别 MWW/BW CSAⅠ/μm2 CSAⅡ/μm2 Prcentage ofⅠfibers/% Prcentage ofⅡfibers/% CON 43.78±4.25 2 587.01±91.23 1 793.46±89.91 13.69±2.13 86.31±2.67 IMM 3194±3.07* 1 904.57±81.04* 1 387.43±92.65* 30.48±3.14a 69.52±3.01a IMM+50 HzHFV 38.91±2.86# 2 289.32±83.57# 1 504.47±84.08# 21.49±2.87# 78.51±2.98# IMM+200 Hz HFV 41.65±4.13# 2 461.14±90.78# 1 639.25±89.41# 16.93±2.91# 83.07±2.87# IMM+400 Hz HFV 39.04±5.12# 2 354.59±87.63# 1 594.56±84.38# 18.16±2.93# 81.84±2.72#

2.2 HFV对制动大鼠梭内肌纤维MHC表达及显微结构的影响

在CON组SOL肌梭的染色结果可以观察到：核袋Ⅰ纤维内无着色沉淀（阴性肌纤维）；核袋Ⅱ纤维多无着色沉淀（阴性肌纤维），少数有浅褐色沉淀（弱阳性肌纤维）；而核链纤维内则出现棕色沉淀（阳性肌纤维）。CON组SOL肌梭结构特征：被囊膜完整，轴周间隙结构正常，核袋和核链纤维区分明显。在IMM组SOL肌梭的染色结果可以观察到：核袋Ⅰ纤维内依然无着色沉淀（阴性肌纤维）；核袋Ⅱ纤维多有褐色沉淀（阳性肌纤维）；而核链纤维内则出现深棕色沉淀（强阳性肌纤维）。这表明制动使梭内肌呈现了慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势。IMM组大鼠SOL肌梭结构特征：梭内肌破坏严重，部分肌膜溶解消失，轴周间隙增宽，内囊壁部分肿胀溶解。振动组大鼠梭内肌纤维着色及显微结构的变化近于正常而无显著的病灶倾向（见图1）。结果提示，在制动期间对大鼠施加HFV可以对抗因制动而引起的梭内慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势。

3 讨 论

MHC是骨骼肌纤维中最重要的肌原纤维蛋白之一，含有与肌肉收缩速度有关的酶活性，维持肌细胞结构的完整性。骨骼肌纤维至少表达6种表型的MHC：MHCⅠ/beta cardiac MHC；MHCⅡa；MHCⅡb；MHCⅡd/x；MHC embryonic；MHC fetal/ neonatal，其表型的变化必然会影响肌纤维的代谢和功能特性。本实验选用以兔的快肌纤维作为免疫源而得到的MHC抗体仅检测快肌MHC的一个表位，可以同梭内、外肌纤维中快肌纤维的所有亚型发生免疫反应，同慢肌则不发生反应。研究表明，在废用状态下，SOL（典型慢肌）会发生明显的萎缩，慢氧化型纤维数量明显减少，而中间型、快氧化型和酵解型纤维数量却增加。我们的实验结果与前期的文献报道一致：废用14天后，SOL梭外肌纤维MHC的表达水平和表型发生了改变，Ⅰ型肌纤维的构成比明显减少，Ⅱ型肌纤维的构成比明显增加，出现了Ⅰ型肌纤维向Ⅱ型肌纤维转化的趋势。

肌梭与骨骼肌在发生学上有着相同的起源与血供来源，与梭外肌为同一反射弧的不同部分。核袋Ⅰ纤维的代谢特点类似慢肌，而核袋Ⅱ纤维和核链纤维则类似快肌。国外学者曾经发现肌肉制动不但可引起肌肉本体感受器的传入冲动减少，而且肌梭的核袋和核链纤维的横截面积也会相应减少[15-18]。本研究结果显示：废用14天后，SOL肌梭的核袋Ⅰ纤维中MHC的表达仍呈阴性，核袋Ⅱ纤维出现由阴性向阳性的转化，核链纤维MHC的表达有所增强，这表明制动使梭内肌呈现了慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势。

将HFV作为外界机械刺激可以提高肌梭的兴奋性，使肌梭的传入放电活动增强，因此HFV常作为一种肌梭敏感性的研究手段，但其作为废用性肌萎缩的对抗措施却少见研究。国外学者发现[19]，对大鼠跟腱施以120 Hz的HFV，可以明显地对抗大鼠失重性肌萎缩的症状。另有研究证实，振动动物的肌肉可以使其初级传入末梢的兴奋性增强，而且还能够增强其某些次级传入末梢的兴奋性，而振动肌腱则仅限于对初级传入末梢兴奋性的增强。因此，考虑到能够更大程度地兴奋肌梭，我们所采用的振动部位与前者有所不同，即由肌腱转为了肌腹。我室前期研究发现，这种肌肉振动方法对制动引起的废用性肌萎缩的具有一定的对抗作用，可使肌梭的传入冲动增加，可以减缓制动大鼠SOL肌纤维横截面积和湿重体重比的减少趋势。本次MHC染色结果显示，在大鼠制动期间给予HFV后，SOL梭外肌Ⅰ型肌纤维的构成比明显上升，同时Ⅱ型肌纤维的构成比明显下降，其中以IMM+200 Hz HFV组的变化最为明显。振动组SOL梭内肌纤维中MHC表达及显微结构的改变均不明显，接近于正常大鼠。结果提示，在制动期间对大鼠施加HFV可以有效地对抗因制动而引起的梭内、外慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势，这与前期的研究结果是一致的；而相对于50 Hz和400 Hz的HFV，肌梭对于200 Hz的振动可能更为敏感。

从以上方面分析，我们认为，HFV对于废用性肌萎缩具有对抗作用，根本原因是由于HFV对肌梭兴奋性的诱发作用。推测其机制为：HFV诱使肌梭的Ia类和Ⅱ类传入纤维的兴奋性增强，加大了肌梭传向中枢的传入冲动总量，通过γ和α神经活动，强化了肌肉运动单位的参与程度，增大了骨骼肌活动的量与强度，改善了梭外肌的代谢环境，从而维持了肌肉的正常结构与功能状态，最终实现对肌肉萎缩的对抗作用。本研究发现HFV可对抗废用后SOLⅠ型肌纤维向Ⅱ型肌纤维的转化和梭内肌MHC表达有增强的趋势，且以200 Hz HFV组最为显著。HFV作为一种对抗废用性肌萎缩的有效措施提供了有力的实验依据。

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Antagonistic Effects of Different Frequency Sinusoidal Vibration Given To Disused Muscle Atrophy in Rats

SHI Lei1，CAO Ruonan2，FAN Xiaoli3，CHEN Longwei1
（1.Dept.of PE，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710049，China；2.School of Foreign Languages，Northwest University，Xi'an 710069，China；3.Dept.of Physiology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China）

Objective：To study the antagonistic effects of different frequency sinusoidal vibration given to disused muscle atrophy in rats under immobilization.Methods：The rats were made into models of disused muscles through the immobilization in their hindlimbs.HFV were applied to the immobilized soleus muscles in the vibration group.The ratio of muscle wet weight to body weight of the soleus muscles，the cross-sectional area，the constituent ratio of skeletal muscle fibers and changes of expression of MHC in intrafusal and extrafusal fibers were detected.Results：①After the 14-day immobilization period，the SOL fibers showed an evident shift toward a decreased percentage of fibers typeⅠ，but an increased percentage of typeⅡ.The expression of MHC in muscle spindle was increased.②Compared with the immobilization group，the SOL fibers in the vibration group showed an evident shift toward a increased percentage of fibers typeⅠ，but an decreased percentage of typeⅡ.The change of expression of MHC in muscle spindle was unconspicuous.Conclusion：HFV was effective in antagonizing the transform of typeⅠtoward typeⅡand the increased expression of MHC in muscle spindle in immobilization rats.The change was the most evident in 200Hz HFV group.

high frequency sinusoidal vibration；myosin heavy chain；muscle spindle

G 804.2

A

1005-0000（2011）06-0482-03

2011-08-30；

2011-10-21；录用日期：2011-10-25

国家自然科学基金项目（项目编号：30901583）；陕西省科学技术研究发展计划项目（项目编号：2009KW-20）；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（项目编号：xjj20100181）

石 磊（1974-），男，山东泰安人，博士，教授，研究方向为运动生理学。

1.西安交通大学体育部，陕西西安710049；2.西北大学外国语学院，陕西西安710069；3.西安交通大学医学院生理学教研室，陕西西安710061。