神经节苷脂对弥散性脑损伤模型大鼠认知功能的改善作用研究

杨 鹏，李 云，张志勇，孙泽林，张立民，李群喜，陈 通，张云鹤，刘清军，邹西峰，付爱军，朱 军

（1.河北联合大学附属医院，唐山市 063007；2.河北联合大学公共卫生学院，唐山市 063007）

弥散性脑损伤（Diffuse brain injury，DBI）是闭合性脑外伤的一种，是神经外科常见急症之一，病情严重，致残率及死亡率均高[1]。DBI后神经损害不仅发生在损伤瞬间，且在其后的数分钟至数天内产生的继发性损伤也很严重[2]，幸存者通常有严重的运动功能障碍。此外，DBI伤后还可出现神经元延迟性死亡，从而导致患者长期认知功能障碍，极大地影响了患者生活质量。神经节苷脂（Ganglioside）是近来治疗DBI的常用药物，其脑保护作用和促进神经功能恢复的作用已引起人们关注。本研究拟采用Morris水迷宫实验和跳台实验研究神经节苷脂对大鼠DBI后认知功能的改善作用，旨在为治疗颅脑创伤患者提供新的理论基础和治疗途径，改善颅脑创伤患者的预后。

1 仪器与材料

1.1 仪器

YLS-3TB大鼠跳台记录仪（上海软隆科技发展有限公司）；SLY-WMS Morris水迷宫分析系统（北京硕林苑科技有限公司）。

1.2 试药

10%水合氯醛（北京化学试剂公司，批号：20021109）；神经节苷脂（齐鲁制药有限公司，批号：20030508，规格：20 mg·2 mL－1），以生理盐水稀释至所需浓度备用。

1.3 动物

Wistar大鼠48只，♂，月龄4个月左右，体重310～390 g，由中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所提供，合格证号：京动许字20000006。动物喂养在河北联合大学动物中心，自然光照，自由进食，1周后进行实验，实验前12 h禁食，不禁水。

2 方法

2.1 建模

根据Marmarou方法建立DBI模型[3]。于致伤前0.5 h，腹腔注射阿托品30 mg·kg－1。腹腔注射10%水合氯醛350 mg·kg－1麻醉大鼠，以75%乙醇消毒术区，沿正中矢状线切开头皮，剥离骨膜，显露冠状缝及人字缝，固定打击垫片在大鼠冠状缝与人字缝之间，将大鼠俯卧位固定于海绵床垫（10×10×20 cm3）上。头部固定于致伤架下，打击锤自2 m高度自由落下，打击后即刻移开大鼠，以防止打击锤造成的二次损伤。致伤后，去除打击垫片，清创缝合伤口。保温复苏后继续饲养。

2.2 分组与给药

将大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组和药物干预组，每组12只，各组间大鼠月龄、体重分布均无统计学差异。正常对照组不作任何处理；假手术组仅给予麻醉及头皮切开、缝合，但不致伤；模型组和药物干预组均建立DBI模型。根据参考文献[4]，药物干预组建模后30 min即刻经腹腔注射神经节苷脂40 mg·kg－1·d－1，其余3组在相同时间内给予等量生理盐水，之后每天于同一时间给予相应药物，连续给药14 d，末次给药后取各组大鼠进行Morris水迷宫实验和跳台实验。

2.3 Morris水迷宫实验

各组大鼠接受不同处理措施前4天为学习训练期。第1天让大鼠自由游泳2 min，从第2天起，每天分上、下午2段，每段训练4次，训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，训练其在180 s内找到安全平台。如果大鼠在180 s内未找到安全平台，需将其引至安全平台。每次训练间隔60 s。采用水迷宫实验图像追踪系统自动记录大鼠在训练前及训练后的活动路线图。经过4 d的学习训练后，大鼠都能在180 s内顺利找到安全平台。

训练完成后将大鼠分组，末次给药后去掉安全平台再次进行水迷宫实验，将大鼠面向池壁，随机选择一个入水点放入池中，根据水迷宫实验图像追踪系统记录结果，计算大鼠在180 s内搜索安全平台的次数、第1次穿过安全平台的时间及在靶像限活动时间，评价大鼠认知功能。

2.4 跳台实验

根据参考文献[5]，将大鼠放入箱内铜栅上，适应5 min，随后通电，大鼠受电击，正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数大鼠可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台。从大鼠电击后逃到安全台上开始记时，再从安全台上下来此段时间为潜伏期，大鼠从安全台上再次跳下为错误反应。如果5 min内大鼠未跳下平台，错误次数记录为0次，潜伏期记为300 s。各组大鼠接受不同处理措施前1天为学习训练期，末次给药后重新测试各组大鼠，记录潜伏期和错误次数。

2.5 统计学方法

数据均用均数±标准差表示，经Excel数据库整理后应用SPSS 11.0统计软件，计量资料进行t检验或方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 建模结果

建模后，24只大鼠均出现呼吸抑制和心跳暂停，给予吸氧、人工呼吸、心脏胸廓按压等抢救措施后，有9只呼吸心跳未能恢复，于伤后l h内死亡，存活大鼠15只，死亡率为37.5%。所有模型大鼠均出现四肢剧烈抽搐，持续15～30 s，随后，前肢呈去皮层屈曲，昏迷状态，多于30 s内恢复心跳和自主呼吸。存活大鼠于5～60 min内清醒，前肢恢复正常。模型大鼠在72 h内反应迟钝，而正常对照组和假手术组大鼠活动正常。

3.2 水迷宫实验结果

正常大鼠水迷宫实验学习训练前和训练后活动路线图见图1。

图1 正常大鼠水迷宫实验活动路线图A.训练前；B.训练后Fig 1 Morris water maze route map of normal ratsA.before training；B.after training

由图1可知，正常大鼠在训练前第1次找到安全平台的时间和路线均较长；经过学习训练后，大鼠第1次找到安全平台的时间和路线均较短，水迷宫实验成绩明显提高。表明大鼠对安全平台位置产生了一定的记忆。末次给药后各组大鼠水迷宫实验活动路线图见图2。

由图2可知，正常对照组和假手术组大鼠水迷宫实验成绩相近，大鼠活动路线集中在靶像限内，表明大鼠学习记忆功能受影响较小；而模型组和药物干预组大鼠水迷宫实验成绩较差，大鼠活动路线分散在各个像限，表明大鼠学习记忆功能受不同程度的影响。与正常对照组和假手术组比较，模型组和药物干预组大鼠第1次穿过平台时间明显延长，搜索安全平台次数、在靶像限活动时间均明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，药物干预组大鼠第1次穿过平台时间明显缩短，搜索安全平台次数、在靶像限活动时间均明显增加（P＜0.05）。各组大鼠水迷宫实验指标比较见表1。

图2 各组大鼠水迷宫实验活动路线图A.正常对照组；B.假手术组；C.模型组；D.药物干预组Fig 2 Morris water maze route map of rats in each groupA.normal control group；B.sham operation group；C.model group；D.drug intervention group

表1 各组大鼠水迷宫实验指标比较（x ±s）Tab 1 Comparison of Morris water maze index among different group（s±s）

表1 各组大鼠水迷宫实验指标比较（x ±s）Tab 1 Comparison of Morris water maze index among different group（s±s）

与正常对照组和假手术组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.normal control group and sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

分组正常对照组（n=12）假手术组（n=12）模型组（n=7）药物干预组（n=8）F在靶像限活动时间/s 123.51±5.91 118.28±5.10 61.38±8.67＊84.59±6.78＊#83.39第1次穿过平台时间/s 4.62±0.58 5.28±0.71 10.15±1.35＊8.02±1.09＊#70.42搜索安全平台次数/次10.1±1.9 10.3±1.8 3.8±2.3＊6.8±1.3＊#24.18

3.3 跳台实验结果

与正常对照组和假手术组比较，模型组和药物干预组大鼠潜伏期时间明显缩短，错误次数明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，药物干预组大鼠潜伏期时间明显延长，错误次数明显减少（P＜0.05）。各组大鼠跳台实验结果比较见表2。

4 讨论

有研究[6]发现，大鼠脑外伤后细胞凋亡高峰出现于伤后48 h，这种伤后神经元的延迟性死亡，可导致长期认知功能障碍。本研究结果进一步证实了DBI后迟发性细胞死亡对大鼠认知功能有一定影响，同时也提示在临床上应尽量减少DBI后的迟发性细胞死亡，从而减轻脑DBI后的认知障碍。此外，本研究中正常对照组和假手术组大鼠在实验第14天搜索安全平台次数的差别无统计学意义，因此可以排除头皮切开等应激反应对大鼠水迷宫实验结果的影响。

表2 各组大鼠跳台试验结果比较（±s）Tab 2Results of step-down test among different group（s±s）

表2 各组大鼠跳台试验结果比较（±s）Tab 2Results of step-down test among different group（s±s）

与正常对照组和假手术组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.normal control group and sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

错误次数/次4.8±1.2 4.6±1.5 9.7±2.8＊7.5±2.3＊#14.36分组正常对照组（n=12）假手术组（n=12）模型组（n=7）药物干预组（n=8）F潜伏期/s 264.83±16.99 262.51±21.54 179.28±31.24＊230.46±24.63＊#25.33

神经节苷脂是从牛脑中提取和纯化的一种复合神经节苷酯，临床证明，其能明显促进外周神经损伤、脊髓损伤和糖尿病神经病变中受损神经的再生和功能恢复[7]；在脑缺血中早期有护脑作用，后期有促进神经功能恢复作用，且具有周围神经镇痛作用。本研究也发现，药物干预组大鼠在180 s内找到安全平台的次数和在靶像限内活动时间明显高于模型组大鼠（P＜0.05），第1次穿过平台时间明显低于模型组（P＜0.05），跳台实验潜伏期时间延长，错误次数减少。其原因可能为药物干预组大鼠使用神经节苷脂后，通过减少神经元的凋亡，改善了大鼠的认知能力。神经节苷脂改善大鼠认知能力的可能机制包括：（1）神经节苷脂可促进神经元的轴突再生，刺激突触形成、激发细胞膜上Na+-K+-ATP酶的活性，增强细胞内蛋白磷酸化过程并改善神经传导速度，从而改善大鼠认知功能；（2）神经节苷脂具有较强的修复神经组织损害的潜力，能加速神经支配功能的恢复。

本研究证实了神经节苷脂对DBI模型大鼠认知能力有改善作用，这也提示在DBI后应尽早使用促进神经组织恢复的药物，以改善患者的预后。

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