海藻有效成分的提取分离研究进展

司晓喜, 袁智泉, 邱贺媛,2, 肖小华＊, 李攻科＊

(1.中山大学化学与化学工程学院,广东广州510275;2.韩山师范学院化学系,广东潮州 521041)

海藻有效成分的提取分离研究进展

司晓喜1, 袁智泉1, 邱贺媛1,2, 肖小华1＊, 李攻科1＊

(1.中山大学化学与化学工程学院,广东广州510275;2.韩山师范学院化学系,广东潮州 521041)

海藻种类多样,资源丰富,提取分离和纯化制备其中结构特殊的有效成分,在藻类天然产品和新药开发等方面有重要意义.本文综述了海藻有效成分的提取分离研究进展,重点介绍了海藻中多糖、脂质、色素、多酚和萜类的提取分离技术,包括溶剂提取、超临界流体提取、加压溶剂提取、超声波辅助提取和微波辅助提取等,以及这些有效成分常用的制备液相色谱、高速逆流色谱等纯化制备技术的应用进展.

海藻;有效成分;提取分离;纯化制备

0 引言

海藻(algae或 seaweeds)种类多样、资源丰富,其特殊的生物形态和生长环境可能产生结构特殊的生物活性物质和代谢产物,是海洋有效成分的主要来源.海藻有效成分具有结构新颖性、多样性和复杂性的特点,主要分为两类:一类是难以被消化吸收的黏性多糖;另一类是分子量较小、吸收后能直接或间接影响体内代谢的物质,包括脂类、酚类、萜类、生物碱和类胡萝卜素等[1].它们具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、抗增殖及调节免疫机能等多种生理活性和药用功能[1-2].深入研究海藻有效成分快速高效的提取分离技术对开发海藻类天然产品、保健品,发掘新的药用成分和先

导化合物具有重要意义.本文综述了近几年来海藻中有效成分的提取分离研究进展,重点介绍了海藻中多糖、脂质、色素等有效成分的提取和分离技术.

1 海藻有效成分的提取技术

海藻有效成分提取通常在室温和避光条件下进行,样品经脱脂、除盐和去色素后,一般采用溶剂提取法如浸渍数小时至几天.超临界流体提取(SFE)、加压溶剂提取(PLE)、超声波辅助提取(UAE)和微波辅助提取(MAE)等现代提取技术在提取效率、提取时间、溶剂消耗量和能耗方面有突出的优势,其中:SFE法条件温和,适合高活性有效成分的提取,主要用于海藻中不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、维生素等亲油性成分的提取;PLE法在高温高压、惰性和避光条件下提取,主要用于海藻中脂肪酸、色素和多酚的提取;UAE法通过超声波的空化作用使藻体细胞破碎,多用于海藻中多糖和色素的提取;MA E法通过微波的内加热作用实现快速高效的提取,用于海藻多糖、色素、多酚的提取;酶解提取法采用酶将细胞壁破坏,有利于保持物质活性,用于海藻多糖、多酚的提取.由于海藻中有效成分性质各异,因此需要针对目标物的性质,结合各种技术的原理、特点和适用范围选取相应的提取方法.

1.1 海藻多糖的提取方法

海藻多糖占海藻干重的50%以上,其种类丰富,具有独特的化学组成、结构和生物活性,逐步成为生物多糖的主要来源之一.

海藻多糖是一类多组分混合物,不同提取方法从不同海藻中得到的多糖组成和活性差异较大.表1列举了海藻多糖的常用提取方法.其中水提、酸提、碱提及沉淀法是海藻多糖提取普遍采用的方法.水提法的中性提取环境可避免多糖的水解并保持其活性;酸提法用于提取溶于稀酸水溶液的多糖,较低的p H值可避免褐藻酸溶出;碱提法常用于提取碱溶性多糖和海藻酸钠;沉淀法常用乙醇和氯化钙为沉淀剂,通常用氯化钙沉淀除去褐藻酸,再以乙醇沉淀得多糖.此外,提取温度、时间、溶剂量及p H值等对多糖的提取率和纯度会产生影响.单一提取法得到的多糖种类单一,而采用多级提取法并结合不同方法可依次得到不同性质的多糖,提高原料的利用率.采用 UA E[5]、MAE[6]以及酶解提取法[4]等能有效提高海藻多糖的提取效率.酶解技术条件温和,可有效保持海藻多糖的纯天然性[4].UAE法和MAE法高效快速,但过长的超声波或微波作用可能使大分子的多糖断裂.此外,UA E法和MAE法提取得到的多糖的组成和活性尚未得到深入研究.如何选择性、快速的提取得到高活性、多组分的海藻多糖,仍需要结合不同提取技术的优势以及多糖活性筛选、结构鉴定等手段进一步研究.

表1 海藻多糖的常用提取方法

1.2 脂质的提取方法

海藻中总脂含量高,脂肪酸组成简单,富含多不饱和脂肪酸(PU FA),如γ-亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等.表2列举了海藻中脂质的常用提取方法.脂质需在低温下提取以防止 PUFA氧化,常采用溶剂提取法,常用溶剂有乙醇、乙醚、石油醚以及氯仿-甲醇等混合溶剂[7].由于不同海藻中PUFA分布于极性脂和中性脂中的含量不同,需要有针对性地选取提取溶剂.此外,通过反复冻融等方法可加速藻体破壁以提高提取效率[8].采用 UAE[8]、SFE[9]和PLE[10]等方法也可提高海藻中脂质的提取效率,特别适合海藻中PUFA的提取.目前海藻的脂质提取物主要用于成分分析或活性测试,较少用于脂肪酸的进一步分离制备.陈炜等[11]将UAE法提取得到的粗脂进行水解和酯化,通过尿素包合法分离和富集得到高PUFA含量的脂肪酸.

表2 海藻中脂质的常用提取方法

1.3 色素的提取方法

海藻色素包括叶绿素、类胡萝卜素和藻胆蛋白3类,海藻中色素的常用提取方法见表3.

海藻中叶绿素含量高,广泛用作天然食用色素,主要采用溶剂提取,提取过程低温避光并避免长时间加热[20].通常以醇类和丙酮为提取溶剂,其中醇类提取效果好,但丙酮提取液稳定.采用SFE和UAE等技术提取叶绿素具有很高的效率,并可避免温度和光等因素所致叶绿素a的降解,其中SFE法已用于工业化生产叶绿素,产率高、产品性质稳定、安全可靠,适合作为食品添加剂生产方法使用[20].

海藻中类胡萝卜素包括胡萝卜素、叶黄素和类胡萝卜酸3类,其功能多样,性质独特,分布广泛,具有很好的开发前景.类胡萝卜素通常采用丙酮、乙醚、石油醚等有机溶剂提取,由于类胡萝卜素酯的存在,采用皂化提取法可得到游离的类胡萝卜素[14],但提取步骤多、时间长.采用UAE[15]、SFE[13]、MAE[16]法能显著加速海藻中类胡萝卜素的提取过程,其中SFE法选择性最高,通过控制压力等条件,可提取得到低叶绿素含量的类胡萝卜素提取物[15].

藻胆蛋白是红藻和蓝藻特有的捕光色素蛋白,属胞内蛋白质,细胞的破碎是提取藻胆蛋白的关键.通常以水为溶剂,通过反复冻融、溶胀、组织捣碎、珠磨、高压均质和超声波震荡等方法实现藻体破碎和藻胆蛋白溶出,其中反复冻融法适于规模化细胞破碎.另外,加入酶(如纤维素酶)或化学试剂(如十二烷基苯磺酸钠)也可破坏细胞壁和细胞膜,使藻胆蛋白渗出[21].采用单一的方法提取效果不佳,通常结合多种方法通过最大限度地破碎藻体来提取.借助UA E[18]和 PLE法[19]等提取技术可大大提高藻胆蛋白的提取效率.

表3 海藻中色素的常用提取方法

1.4 酚类的提取方法

酚类是海藻抵抗生物吞食及抗感染的重要物质,包括简单酚类和多酚类.通常采用水提法和有机溶剂提取法,此外 UAE、MAE、SFE和酶提取法等也有应用.多酚对温度敏感,一般在暗室浸提,如Shibata等[22]采用甲醇提取穴状昆布和嘉祐中的多酚时,样品于室温浸提3 h后分散匀浆,经多步溶剂提取得到多酚粗提物.用有机溶剂提取的多酚,其纯度、提取率比水提法高,但产品的抗氧化程度和安全性较低.酶解法条件温和,提取率高,能较好地保持提取物的抗氧化性[23].SFE法[24]的溶剂极易渗透到海藻的基质中,可从钝顶螺旋藻中提取到低含量的酚类物质,提取率高,无溶剂残留,且操作温度低而不破坏有效成分.采用MAE法以体积比为15%乙醇水溶液提取鼠尾藻总多酚,微波作用40 s的提取效果优于UA E法,且快速高效[25].

1.5 萜类的提取方法

萜类是海藻保护自己所产生的最具代表性的次生代谢物,多数为卤代或芳香族萜类化合物,生物活性强,一般采用有机溶剂提取.藻体以甲醇和乙醇反复浸提,提取物再以乙酸乙酯等提取萜类化合物,如 Fisch等[26]以甲醇从囊叶藻中提取具有抗氧化性的混源萜类化合物,提取液经二氯甲烷反复提取可得到萜类粗提物.李娜等[27]采用SFE法于30 MPa、40℃下提取蜈蚣藻中萜类化合物仅需2 h,且提取温度低、时间短、得油率高.

为了提高海藻的利用率,采用多级提取法将各成分所需的提取法按一定的顺序有机结合起来,可从海藻中逐一获得各有效成分.此外,SFE、UAE、PLE和MAE等提取技术所表现出的快速高效、自动化和产品质量高等优点,在海藻有效成分提取中有巨大的发展前景.

2 海藻有效成分的纯化制备技术

通过各种提取技术从海藻中获得的提取液,一般混有较多杂质,为了进一步阐明其中有效成分的结构及生物活性等,需要借助快速有效的纯化技术制备有效成分对照品.其中液-固色谱技术最为常用,制备量可达毫克至克级,供选择的固定相多样,可满足海藻中不同性质有效成分的分离,如硅胶可用于脂肪酸、类胡萝卜素、萜类、甾醇等极性化合物和不饱和化合物的分离,离子交换树脂和凝胶用于海藻多糖的分离.通常以传统色谱法如柱色谱(CC)和制备薄层色谱(PTLC)等对海藻粗提物进行初步分离,并结合制备液相色谱纯化得到化合物纯品.目前,HSCCC在海藻中的应用限于脂肪酸和类胡萝卜素的分离,用于毫克级纯品的制备,但其可直接分离粗提物,且条件温和,可供选择的溶剂体系多样,弥补了制备液相色谱样品前处理要求高的不足.

2.1 传统液-固色谱技术

以柱色谱和薄层色谱为主的传统液-固色谱分离能力有限,但其设备要求低,简单方便,制备量大,主要用于海藻粗提物的初步分离.

柱色谱制备量可达毫克至克级,主要用于纯化的第一步.硅胶柱、离子交换柱、凝胶柱等常用于海藻中有效成分的制备,其中硅胶柱使用最为广泛,如 Kanazawa等[28]采用活性炭分散硅胶为填料的工业规模柱色谱,从10 t昆布中分离得到1 490 g岩藻黄素,回收率达82%,但产品纯度较低.凝胶柱的分辨率较硅胶柱低[29],但简单快速,适用于海藻多糖、抗凝血剂的分离.离子交换色谱常用于海藻中多糖和藻蛋白的分离[30],也用于除盐[31].制备薄层色谱常用于分离几十毫克至几百毫克的样品,一般作为纯化的第二步,经常配合柱色谱使用.Kittaka-Katsura等[32]采用硅胶PTLC进一步分离由柱色谱从小球藻中分离得到的活性组分,得到富含维生素B12的组分.

2.2 制备液相色谱技术

制备液相色谱可实现克级以上样品的分离.根据压力可分为快速色谱(约0.2 MPa)、低压液相色谱(＜0.5 MPa)、中压液相色谱(0.5～2.0 MPa)和高压液相色谱(＞2.0 MPa).最常采用的是制备型和半制备型 HPLC,其柱长短、内径大、填料颗粒小,在高压高流速下其分离效率极高,而且自动化和多功能化,通常作为海藻有效成分分离的最后一步(精制有效成分).表4中列举了制备液相色谱在海藻有效成分分离纯化中的应用.

表4 制备液相色谱在海藻有效成分分离纯化中的应用

根据海藻中有效成分的性质选择色谱柱尺寸、固定相种类(硅胶、C18、凝胶等)和粒度、分离模式(反相、正相、离子交换、体积排阻等)、压力、流动相等.快速色谱用于复杂混合物的预先分离,低压液相色谱可作为中间或最后的分离步骤,中压液相色谱比低压液相色谱有更高的分辨率和更短的分离时间,可用于最后的纯化步骤,如用于分离裙带菜和孔石莼的脂肪酸粗提物,上样量达600mg,可获得多种高纯度的 PUFA[33].HPLC的柱效更高,但其色谱柱易污染,样品需预处理除杂,通常用于粗品的精制.分析型 HPLC也可精制得到毫克级纯品,如 Cho等[34]采用分析型HPLC纯化由柱色谱从铁钉菜中分离得到的粗提物,获得毫克级高纯度的甲氧基脂肪酸.此外,高效离子交换色谱、高效凝胶色谱等常用于海藻多糖等有效成分的纯化制备.于广利等[35]采用高效强阴离子交换色谱从刺松藻粗多糖中分离得到11种结构不同的多糖组分.制备液相色谱作为海藻有效成分纯化制备中的关键技术,结合预分离技术对粗提物预先纯化,可提高其制备量和纯化效果.

2.3 高速逆流色谱技术

高速逆流色谱(HSCCC)是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术,无需固相载体,可直接分离粗提物,避免了因不可逆吸附以及样品前处理步骤引起的样品损失、失活、变性等,能完整保留目标物活性,回收率高,已用于从海藻粗提物中分离制备脂肪酸、类胡萝卜素,以及粗提物的预分离.Chen等[38]以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(体积比为8∶2∶7∶3)为溶剂体系,采用 HSCCC从150 mg微囊藻的皂化提取物中分离得到纯度大于96.2%的玉米黄质,回收率达 91.4%.与HPLC相比,HSCCC的分离过程和机理大为简化,极大地克服了 HPLC色谱柱易污染、分离重现性差、目标物在分离过程中易变化的问题.Bousquet等[39]采用 HSCCC通过两步分离获得高纯度的亚麻酸、十八碳四烯酸、EPA和DHA,上样量达130 g,且不饱和脂肪酸活性不变.

2.4 其他分离纯化技术

膜分离技术、分子蒸馏技术等也常用于海藻有效成分的分离制备.膜分离是以选择性透过膜为分离介质,包括微滤、超滤、纳滤和反渗透等,特别适用于海藻中多糖等的分离纯化.Ye等[40]采用超滤技术,以1.0×10-4mm孔径的膜过滤马尾藻的多糖提取液,得到3个粗多糖组分.采用超滤技术还可提高海藻酸钠成品的纯度、黏度、色泽等[41],该方法在海藻酸钠大规模工业分离、提纯等方面极具发展前景.

分子蒸馏技术用于液-液分离或精制,在高真空、远离沸点下操作,具有温度低、受热时间短、分离效率高等特点,适合于热敏性、高沸点物质的分离.石勇等[42]将分子蒸馏法与 SFE法结合,从螺旋藻中分离得到多种脂类和生物碱.

海藻样品基体复杂、化合物结构多样,采用单一技术难于分离得到高纯度产品.通常先用分离效率较低但简单、上样量大的PTLC、柱色谱和快速色谱预处理海藻提取物,得到不同性质的混合组分,然后采用柱效高的制备液相色谱进一步分离制备,即集成多种分离技术提高分离制备效率.王威等[36]采用溶剂萃取和大孔吸附树脂柱色谱预分离羊栖菜的提取物,得到的各组分再结合硅胶柱色谱和制备型 HPLC分离,可得到高纯度的6种甾醇和2种糖脂,制备得到的有效成分种类多,大大提高了分离纯化效率和原料的利用率.

3 结论

随着人们对海藻及其有效成分认识的逐步深入,海藻有效成分的价值正逐步得到认同,大规模开发利用海藻类天然产物已成为当前研究的热点,但海藻有效成分对照品缺乏、开发成本高昂成为其开发利用的瓶颈.如何在分离纯化技术上取得突破,低成本、高效益地获得高纯度的海藻有效成分及其对照品极为迫切.借助超临界流体提取、加压溶剂提取、微波辅助提取等快速高效的提取技术以及高效的制备液相色谱、高速逆流色谱纯化技术,开展海藻等天然产物有效成分的分离纯化技术研究,将会大大促进海藻类天然产物的开发和应用,为我国的经济发展和人类健康做出更大的贡献.

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Advance of Separation and Purification Techniques for Active Components from Algae

SIXiao-xi1, YUAN Zhi-quan1, Q IU He-yuan1,2, XIAO Xiao-hua1＊, L IGong-ke1＊

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China;

2.DepartmentofChemistry,HanshanNormalUniversity,Chaozhou521041,China)

Separation and purification of active components from algae are great significant to the development of algal natural p roducts and ne wdrugs.The recent advance on the extraction,separation and purification techniques for the algae active components are summarized and reviewed in this paper.Especially,the application p rogress of extraction techniques fo r polysaccharide,lipid,pigment,polyphenol and terpene in algae including solvent extraction,supercritical fluid extraction,p ressurized liquid extraction,ultrasonic-assisted extraction and microwave-assisted extraction are summarized.Moreover,the commonly used separation techniques for these active components in algae such as p reparative liquid chromatography and high-speed countercurrent chromatography are also introduced.

algae;active components;extraction;separation and purification

O658.9

A

1004-4353(2011)02-0103-08

2011-04-23

国家自然科学基金资助项目(20905080);广东省科技计划项目资助课

题(2009B010900021,2010B030600012)

＊通信作者:肖小华(1978—),男,副教授,研究方向为食品安全分析;李攻科(1963—),女,教授,研究方向为复杂体系分离分析.