固相萃取高效液相色谱法同时测定五仁醇浸膏中的5种木脂素

赵锦花, 王治国, 张小勇

(1.延边大学分析测试中心,吉林延吉133002;2.延边大学理学院化学系,吉林延吉133002)

固相萃取高效液相色谱法同时测定五仁醇浸膏中的5种木脂素

赵锦花1,2, 王治国, 张小勇1＊

(1.延边大学分析测试中心,吉林延吉133002;2.延边大学理学院化学系,吉林延吉133002)

建立了五仁醇浸膏中5种木质素(五味子醇甲、五味子醇乙、五味子脂甲、五味子甲素和五味子乙素)的快速检测方法,并采用固相萃取高效液相色谱法对其进行了检测.结果显示:五味子醇甲、五味子醇乙、五味子脂甲、五味子甲素和五味子乙素进样量分别在0.048 8～2.44、0.040 8～2.04、0.049 6～2.48、0.036 0～1.80和0.048 0～2.40μg范围内具有良好的线性关系(R2≤0.999 8);平均加样回收率分别为101.24%、99.52%、103.72%、98.66%和98.08%,RSD≤1.62%.实验表明,固相萃取-高效液相色谱法具有简便、准确、稳定、灵敏度高、重现性好等优点,可用于五仁醇浸膏的质量控制.

固相萃取;高效液相色谱法;五仁醇;木脂素

0 引言

五仁醇浸膏是中药原料药,系五味子核仁的醇提取物,具有滋补肝肾、养心安神等功效,临床广泛用于急慢性、迁延性肝炎(GPT偏高而具有肝肾阴虚之症者)以及心肾不交、心胆气虚、心脾不足所致的失眠等疾病[1-2].研究[3]表明,五仁醇中含有大量的抗自由基活性成分——木脂素类化合物,如五味子甲素、乙素、丙素、五味子酚等,其中主要抗自由基活性成分为五味子醇甲、五味子乙素等.现行五仁醇质量标准有卫生部标准(WS3-B-3353-98)[4]和《中国药典》[5],其中测定五味子乙素的含量采用比色法,测定五味子醇甲的含量采用高效液相色谱法.由于五仁醇成分复杂,利用单一化学成分评价其产品质量存在着许多问题.为了更有效地控制其产品质量,本文建立了同时测定五仁醇浸膏中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子脂甲、五味子甲素和五味子乙素含量的固相萃取-高效液相色谱(HPLC)法.

1 实验材料

SPE和溶剂信息;Agilent 1100高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器(DAD);Sartorius BP 210S型电子分析天平;AS 10200B型超声波清洗器(天津市恒奥科技发展有限公司公司);五仁醇浸膏样品(吉林省华惠生物科技有限公司);五味子醇甲、脂甲、甲素、乙素对照品(中国药品生物制品检定所 ,批号分别为 200608、200302、200408、200508),五味子醇乙(上海融禾医药科技有限公司,批号为100412);甲醇为色谱纯;水为纯化水.目标物的结构信息如图1所示.

图1 目标物的结构图A.五味子醇甲;B.五味子醇乙;C.五味子脂甲;D.五味子甲素;E.五味子乙素

2 方法与结果

2.1 色谱分析条件

色谱柱为Zorbax Extend C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为水(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0～22 min,65%B;22～32 min,65%～75%B;32～42 min,75%B;42～62 min,75%～95%B),流速为0.8 m L/min,柱温为25 ℃,检测波长为250 nm.在选定条件下,5种对照品和样品中其他组分的色谱峰可达到基线分离,按五味子醇甲峰计算,理论塔板数在5 000以上.色谱图见图2.

图2 目标物的高效液相色谱图(A.混合标准样品;B.加标五仁醇浸膏样品)a.五味子醇甲;b.五味子醇乙;c.五味子脂甲;d.五味子甲素;e.五味子乙素

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素对照品各 6.1、5.1、6.2、4.5、6.0 mg,置于25 m L容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度即得混合对照品溶液(5种组分的质量浓度分别为 0.244、0.204、0.248、0.180、0.240 mg/mL),在冰箱内保存备用(4℃).

2.2.2 供试样品溶液的制备 精密称取样品50.0 mg,置于50 mL容量瓶中,加甲醇溶解,超声震荡10 min;用甲醇稀释至刻度,摇匀,0.45 μm滤膜滤过,收集续滤液.准确取300μL续滤液,过 Florisil SPE柱,用50mL二氯甲烷缓慢淋洗.收集洗脱液,用氮气流吹干,残渣用300μL甲醇溶解,0.45μm滤膜滤过,取100μL续滤液作为供试品溶液.

2.2.3 Florisil SPE柱的制作 将Florisil(60～100目)填料于350℃灼烧活化4 h,冷却后放入干燥器内保存;称取2 g Flo risil放入烧杯中,加入10 mL二氯甲烷,搅拌均匀.将10 m L医用注射器作为层析柱,首先于层析柱底部塞入松紧适宜的玻璃棉,再加入经130℃烘烤2 h的无水硫酸钠0.5 g,加5mL二氯甲烷;然后填装已充分浸泡的Florisil,二氯甲烷淋洗;最后加入无水硫酸钠0.5 g,二氯甲烷淋洗,液面高出填料层2 cm.装填过程中不断轻敲管壁,使各种填料均匀装填及排出气泡.

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系 分别精密吸取混合对照品溶液 10、20、50、100、200、500、1 000μL 置于 1m L容量瓶中,加甲醇稀释至刻度.精密吸取上述溶液10μL,注入液相色谱仪,测定其峰面积值,以峰面积Y对进样量X(μg)进行回归,得到5种组分的回归方程及线性相关系数,见表1.

表1 回归方程及线性范围

2.3.2 精密度 精密吸取混合对照品溶液10 μL,重复进样5次,测定5种组分的峰面积积分值,其 RSD 分别为 0.68%、0.59%、0.49%、0.51%和0.40%.

2.3.3 稳定性 精密吸取样品批号为11035的供试品溶液 10μL,分别于 0、2、4、8、12 h 进样 ,测定5种组分的峰面积积分值,其 RSD分别为0.43%、0.70%、2.30%、1.64%和 0.73%.

2.3.4 重现性 取批号为11035的样品,按“2.2.2”方法制备5份平行供试品溶液,分别进样10 μL,测定5种组分的峰面积并计算样品中含量,其 RSD分别为 0.43%、0.12%、1.66%、0.85%和0.35%.

2.3.5 加标样品回收率 精密称取已测定含量的11035批号五仁醇样品6份(每份 50.0 mg),置于50m L量瓶中,分别准确加入8.5 m L混标(5种组分的质量浓度分别为0.244、0.204、0.248、0.180、0.240 mg/mL),加甲醇溶解 (超声波处理)并稀释至刻度,摇匀,0.45μm滤膜滤过,收集续滤液.按“2.2.2”方法进样10μL进行测定,计算回收率.五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的平均回收率和RSD分别为:101%,0.41%;99%,1.62%;104%,1.33%;99%,0.79%;99%,0.77%.

2.5 样品测定

分别取3个批号的样品,按“2.2.2”方法制备供试品溶液,分别进样10μL,测定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的峰面积并计算其含量,结果见表2.

表2 样品含量的测定结果(n=3) mg/g

3 结论

本文在优化色谱条件和净化条件的基础上,采用固相萃取高效液相色谱法对批号为11030、11033和11035的实际样品进行了分析测试.结果表明:各批次中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素的含量都较高,五味子脂甲的含量较低,这与文献[8]相符,含量较高的4种木脂素在一定程度上能够反映五仁醇质量,可以将其作为质量控制指标;批号为11033的样品上述5种木脂素的整体含量相对较低,这可能是药材产地不同导致,所以今后在测试中应注意保持原料来源的相对稳定.本方法样品前处理简单,回收率高,重现性好,不但可以提高分离效率和灵敏度,而且延长了分析柱的使用时间,能够满足日常分析检测的要求,为五仁醇浸膏的质量控制提供了有效手段.

[1]刘大伟,吴琳华,邵兵,等.五仁醇的研究进展[J].中医药信息,2010,27(3):123-124.

[2]刘继永,王英平,刘洪章,等.五昧子化学成分及药理研究进展.特产研究[J].2005,(3):49-53.

[3]Hancke J L,Burgos R A,Ahumada F.Schisandra Chinensis(Turcz.)Baill.[J].Fitoterapia,1999,70(5):451-471.

[4]卫生部药典委员会编.中华人民共和国卫生部药品标准:中药成方制剂(十九分册)[S].北京:化学工业出版社,1998:19-33.

[5]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(1部)[S].北京:化学工业出版社,2005:44-45.

[6]Halstead CW,Lee S,Khoo C S,et al.Validation of a Method fo r the Simultaneous Determination of Four Schisandra Lignans in the Ra wHerb and Commercial Dried Aqueous Extracts ofSchisandra Chinensis(Wu Wei Zi)by RP-LC with DAD[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2007,45(1):30-37.

[7]Zhang Hai,Zhang Guoqing,Zhu,et al.Determination of Six Lignans inSchisandraChinensis(Turcz.)Baill.Fruits and related Chinese multiherb remedies by HPLC[J].Food Chemistry,2009,115(2):735-739.

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SPE-HPLC for Simultaneous Determ ination of Five L ignans from Nuts Alcohol

ZHAO Jin-hua1,2, WANG Zhi-guo, ZHANG Xiao-yong2＊
(1.AnalysisandInspectionCenter,YanbianUniversity,Yanji133002,China;2.DepartmentofChemistry,CollegeofSciences,YanbianUniversity,Yanji133002,China)

A rapid and simp lemethod based on solid phase extraction(SPE)combined with HPLC was developed and validated fo r sim ultaneous determination of five lignans(Schizandrin,Schizandrol B,Schizantherin A,Deoxyschizandrin and Schizandrin B)from Nuts Alcohol.The Schizandrin,Schizandrol B,Schizantherin A,Deoxyschizandrin and Schizandrin B were showed good linearity(R2≤0.999 8) within range of 0.048 8-2.44,0.040 8-2.04,0.0496-2.48,0.036 0-1.80 and 0.048 0-2.40μg,and the average recoveries were 101.24%,99.52%,103.72%,98.66%and 98.08% with lo wrelative standard deviation(RSD≤1.62%),respectively.The results sho wn that the SPE-HPLC is a convenient,sensitive,robustness,rep roducible and accurate p rotocol,it can be routinely used in the quality control of Nuts Alcohol.

SPE;HPLC;nuts alcohol;lignans

282.5

A

1004-4353(2011)02-0152-04

2011-05-04

吉林省科技发展计划项目资助(20100343)

＊通信作者:张小勇(1970—),男,实验师,研究方向为色谱分析.