6个新的STR基因座复合扩增体系的建立及应用

刘俊宏，邵伟波，李 莉，杨 颖

（1.华东政法大学，上海200042；2.苏州大学 医学部法医学系，江苏 苏州215123；3.司法部司法鉴定科学技术研究所，上海市法医学重点实验室，上海200063；4.上海市血液中心，上海200051）

短串联重复序列（short tandem repeat，STR）通常是由长度为2～5个碱基的核心序列串联重复而成，具有分布广泛、多态性高及易于扩增等特性[1]，STR分型已成为法医物证检验的主要技术手段。目前我国广泛使用的试剂盒主要为Identifiler○R，SinofilerTM和Powerplex○R16 System，基本上可以满足个体识别和亲子鉴定的需要，但在突变和特殊案件中，需要检测更多的STR基因座来补充当前STR系统的不足。本研究选择了非CODIS系统的6个基因座，即D4S2366、

D3S3045、D18S1002、D20S481、D22S689、D4S2639，建立了荧光复合扩增检测体系，并将该体系应用于224名华东汉族无关个体的基因型检测，评估了其作为新的遗传标记在华东汉族人群中的法医学价值。

1 材料和方法

1.1 样本

224份血斑（每份约3mm×3mm大小），分别来源于华东地区汉族无关个体，Chelex-100法[2]提取血液DNA。

1.2 引物

6个基因座的荧光引物序列来自GDB基因组数据库，其具体信息和荧光素标记见表1。所有引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.3 PCR复合扩增体系及产物检测

PCR复合扩增体系为20μL，内含10×PCR buffer 2 μL，2 mmol/L dNTPs 2 μL，25 mmol/L Mg2+2 μL，primer pair mix 2μL，AmpliTaq GoldR○DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板量5μL，纯水6.5μL。采用9700型扩增仪（美国AB公司）进行扩增，循环参数为：95℃15min；94℃30s，56℃90s，72℃60s，循环30次；60℃60min；4℃保存。

取PCR扩增产物1μL、去离子甲酰胺（美国AB公司）10μL、内标SIZ-350（无锡中德美联生物技术有限公司）0.3μL混合，95℃变性3min，冰浴3min，使用3130遗传分析仪（美国AB公司）电泳检测。

1.4 等位基因测序、命名

根据在GALAXY网站上查到的DNA序列，采用Primer premier5.0软件设计用于克隆测序的PCR引物，其具体信息见表2。设计好的引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。选取每个基因座各个等位基因的样本，用所合成的测序引物分别对其进行PCR扩增，产物送上海生工生物工程技术有限公司进行测序，根据各等位基因的测序结果，确定核心序列重复次数，按照国际法医血液遗传学会DNA委员会ISFH推荐的命名原则进行命名[3~4]。

表1 复合扩增体系中6个基因座的引物特征

表2 6个基因座的测序引物特征

1.5 等位基因梯度标准（Allelic Ladder）的制备

选取各基因座含不同等位基因的样本，用荧光标记引物单独扩增后，通过多次调节模板量浓度、扩增次数及混合比例，制备Allelic Ladder。

1.6 灵敏度检测

将标准品DNA 9947A（10ng/μL）稀释成如下浓度梯度：2 ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.125ng/μL、0.0625 ng/μL、0.03125 ng/μL、0.015625 ng/μL，用复合扩增体系进行扩增，扩增产物在3130遗传分析仪上电泳检测。

1.7 统计学分析

运用PowerStats V12.xls[5]软件统计分析D4S2366等6个非CODIS STR基因座的等位基因频率、杂合度（H）、个体识别能力（DP）和多态信息含量（PIC）等参数，采用Cervus2.0软件统计分析二联体非父排除率（PED）和三联体非父排除率（PET），并进行Hardy-Weinberg平衡检验，检验水准α=0.05。

1.8 排除效能统计

运用所建立的复合扩增体系，对93个经Sinofiler试剂盒（美国AB公司）检测已排除非父的二联体案例进行分析，讨论其在实际案例中的运用价值。

2 结果

2.1 6个STR基因座的荧光标记复合扩增体系

本文构建的6个非CODIS STR基因座荧光标记复合扩增体系分型稳定，具有种属特异性，且适用于各类生物学检材。标准品DNA 9947A的分型结果见图1。

2.2 6个STR基因座各等位基因测序结果

通过测序得到6个STR基因座每个等位基因的核心重复序列（见表3），按国际法医遗传学会推荐原则，以核心序列重复次数命名等位基因。

2.3 Ladder制备结果

将6个STR基因座的各个等位基因用荧光标记引物进行扩增，依照荧光强度调节各个PCR产物的比例，制成Ladder见图2。

2.4 灵敏度检测结果

将标准品DNA 9947A（10ng/μL）稀释成如下浓度梯度：2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.125ng/μL、0.0625ng/μL、0.03125ng/μL、0.015625ng/μL，用复合扩增体系进行扩增，扩增产物在3130遗传分析仪上电泳分离，使用Genemapper软件分析结果。在四种荧光素中，ROX产生的峰高普遍低于其它荧光素，通过观察用ROX标记的基因座的峰高，发现20 μL体系中模板DNA浓度为0.125ng/μL时效果最好，但浓度低至0.03125ng/μL时仍能得到正确的分型结果，提示该体系的灵敏度为156.25pg。

表3 6个STR基因座各等位基因的序列特征

2.5 6个基因座的等位基因频率分布

图1 标准品DNA9947A分型图

在华东地区汉族 224名无关个体中，6个非CODIS STR基因座共检出52个等位基因，各等位基因频率见表4。

图2 6个STR基因座的Allelic Ladder

2.6 法医学参数

经过统计分析，D4S2366等6个STR基因座的杂合度（H）分布为 0.714～0.808，个体识别率（DP）为0.874～0.934，二联体非父排除率（PED）为0.310～0.453，三联体非父排除率（PET）为0.485～0.628，多态信息含量（PIC）为0.672～0.784，基因型频率分布通过Hardy-Weinberg平衡检验（P＞0.05），见表5。6个STR基因座的二联体累积非父排除率（CPED）为0.947689，三联体累积非父排除率（CPET）为0.993345，累积个人识别能力（CDP）为0.999999543。

2.7 实际案例应用

将复合扩增体系应用于93例二联体排除案例，每个基因座的排除概率（见表6）与其二联体非父排除率（PED）指标（见表5）基本一致。

表4 6个STR基因座在华东汉族人群的等位基因频率分布 （n=224）

表5 华东汉族人群6个STR基因座的相关法医学参数（n=224）

3 讨论

构建荧光标记复合扩增体系的主要步骤包括基因座的选择、引物设计、扩增体系和扩增条件的优化。引物的设计选择要有高度特异性，不同引物之间不能互相干扰，应避免引物二聚体、发夹结构等，同时还需要考虑片段大小等因素。本研究采用的是多重PCR扩增体系，作者通过大量实验调整各个基因座的引物量，最终得到了比较理想的配比方案。同时，对退火温度及循环次数也进行了梯度试验，建立了合适的PCR扩增方法。复合PCR体系中，模板浓度的最低量为0.03125ng/μL，各个STR基因座的扩增片段大小均小于350bp，因此适用于降解检材的DNA分型。

本文选择的是6个非CODIS STR基因座，通过对华东汉族224个无关个体的检测，在D4S2366、D3S3045、D18S1002、D20S481、D22S689、D4S2639STR基因座分别检出 7、8、9、10、9、9个等位基因和 21、26、21、23、28、32种基因型，各基因座的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡。6个基因座中，D4S2639非父排除率最高，D20S481非父排除率最低，各基因座平均杂合度（H）为 0.760，平均个体识别率（DP）为0.910，平均多态信息含量（PIC）为0.735，二联体累积非父排除率（CPED）为0.947689，三联体累积非父排除率（CPET）为 0.993345，累积个人识别能力（CDP）为0.999999543，表明上述6个STR基因座在中国汉族人群中具有高度的多态性，其复合扩增体系的效能适用于法医学个人识别。另外，作为常规STR标记的补充，上述6个基因座可用于存在突变情形的二联体、三联体鉴定，也可用于因累积亲权指数低于标准值[6]而不能明确鉴定意见的亲权鉴定案件。

表6 6个基因座在实际案例中的排除率 （n=93）

[1]Schuler GD，Boguski MS，Stewart EA，et al.A gene map of the human genome[J].Science，1996，274（5287）：540-546.

[2]Walsh P S，Metzger D A，Higuchi R.Chelex-100 as a medium for simple xtraction of DNA for PCR-based typing from forensic materia[J].Biotechniques，1991，10：506-513.

[3]Lincoln P J.DNA recommendations-further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems.Forensic Sci Int.1997 Jun 23，87（3）：181-184.

[4]Bär W，Brinkmann B，Budowle B，et al.DNA recommendations.Further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems.International Society for Forensic Haemogenetics[J].Int J Legal Med，1997，110（4）：175-176.

[5]Promega Biotech Co.，Ltd.Powerstates V12.xls.[EB/OL] http：//www.promega.com/geneticidtools/.

[6]司法部司法鉴定技术规范[S].SF/Z JD0105001-2010.