柱前衍生HPLC分析银耳多糖的单糖组成

颜 军， 侯贤灯， 徐开来

（1．四川大学化学学院，四川 成都 610064；2．成都大学中药化学实验室，四川 成都 610106）

柱前衍生HPLC分析银耳多糖的单糖组成

颜 军1，2， 侯贤灯1， 徐开来1

（1．四川大学化学学院，四川 成都 610064；2．成都大学中药化学实验室，四川 成都 610106）

建立1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色谱法分离检测5种单糖的方法。根据单糖PMP衍生物的峰面积大小，对衍生化反应中反应时间、PMP与NaOH的量、中和温度和盐酸用量进行了考察，从而得到较佳的衍生化样品制备条件。以20mmol·L-1磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，考察了pH值和乙腈体积分数对糖衍生物分离的影响，确定最佳pH值为6.72，最佳乙腈体积分数为18%，并将该方法应用于银耳酸性多糖的单糖组成的测定。

单糖；多糖；高效液相色谱；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮

1 引 言

银耳在我国已有悠久的药用和食用历史。近年来，对银耳的化学成分及药理活性所进行的研究和大量的现代药理证明，多数药理活性都与银耳多糖有关，特别是酸性银耳多糖。成都大学中药化学实验室对银耳多糖进行了分离纯化，得到了酸性银耳多糖纯品TPP2[1]。而多糖的单糖组成测定则是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的重要环节。

由于单糖分子的多样性，关于糖的分析方法仍在不断发展。单糖组分的色谱分离测定方法目前主要有高效液相色谱法（HPLC）[2-3]、气相色谱法（GC）[4-5]、薄层色谱法（TLC）[6]等。采用GC测定糖类，由于糖本身没有足够的挥发性，所以必须在气相色谱分析之前预先转化成易挥发、热稳定性较强的衍生物，分析过程较为复杂。另外，在糖衍生物的制备过程中，又常会产生衍生物的异构体，在色谱分析时每种糖可能会产生几个峰，这往往影响组分的分离和定量测定。

采用HPLC分析单糖组成的难点在于单糖本身没有紫外吸收，人们常将多糖水解后采用柱前或柱后衍生化色谱法分离和检测，以改善其分离选择性和提高检测灵敏度。在众多的衍生化方法中，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色谱法因反应条件较温和、产物无立体异构、紫外检测灵敏度较高，得到较为广泛的应用[7]。该文选取PMP作为柱前衍生化试剂，用高效液相色谱法分离检测5种单糖，通过对衍生化条件的考察以及色谱分离条件的选取，建立了银耳多糖的单糖组成分离测定方法，具有较好的实用意义。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

日立LC-2000高效液相色谱仪，包括L-2130二元泵，L-2450 DAD检测器。

衍生化试剂：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），纯度 99%（美国 Acros Organics公司）；乙腈（色谱纯，成都科龙化工试剂厂）；盐酸（国药集团化学试剂有限公司）。

单糖标准品：葡萄糖（Glc，99%）、甘露糖（Man，99%）、半乳糖（Gal，≥99%）、鼠李糖（Rham，≥99%）、木糖（Xyl，98%）均购于上海化学试剂公司；超纯水；其他试剂均为分析纯。

银耳酸性多糖TPP2由成都大学中药化学实验室自制[1]。

2.2 混合单糖标样的衍生

分别取200μL的混合单糖标准液（各单糖摩尔浓度均为 1mmol·L-1）与 120μL 的 0.25mol·L-1NaOH溶液，加120μL 0.50mol/L的PMP甲醇溶液，置于5mL的具塞试管中漩涡混匀；在70℃水浴中反应90min；取出置冷水浴中 10min；加 120μL 0.30mol·L-1的HCl中和；再加2mL的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，如此萃取3次。将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析。

2.3 样品制备

吸取1mL质量浓度为4～5 g·L-1的多糖样品溶液于安瓿瓶中，加入100μL的2.00mol·L-1H2SO4，充N2封管，110℃烘箱中水解2h[3]。冷却后，NaOH溶液中和至中性，然后按“2.2”法进行衍生化反应。

2.4 色谱条件

色谱柱：大连江申 C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相：20mmol·L-1磷酸盐缓冲液（pH 6.72）-乙腈（ν∶ν 为 82∶18）；柱温：30℃；检测波长：250 nm；流速：1mL·min-1；进样体积：20μL。

3 结果与讨论

3.1 流动相pH及乙腈体积分数对分离的影响

反相分离单糖PMP衍生物时，常以缓冲液-乙腈为流动相。该文首先考察了乙腈比例（15%、18%、21%）对上述5种单糖在C18柱上的保留值及分离效果的影响。结果显示，15%乙腈时半乳糖和木糖衍生物出峰太迟且峰较宽；21%乙腈时甘露糖衍生物峰与PMP峰重叠无法分开，同时半乳糖和木糖衍生物峰的分离也不佳；而乙腈的体积分数为18%时分离较好（见图1）。此外，缓冲液的pH对糖衍生物的分离也是一重要的影响因素。实验进一步考察了醋酸缓冲液（pH 5.43）和磷酸缓冲液（pH 6.72）对各种糖衍生物的保留值及分离效果的影响。结果表明，采用pH为6.72的磷酸缓冲液时分离效果最佳，分析时间较短，出峰间距较均匀。因此，确定流动相为磷酸盐缓冲液（pH 6.72）-乙腈（ν∶ν 为 82∶18）。该文方法不需梯度洗脱即可同时实现5种单糖衍生物的分离，且分离效果较好。

图1 衍生样品色谱图

3.2 PMP与NaOH的量对衍生化反应的影响

在衍生化反应中，为了保证单糖完全反应，一般采用PMP的量大大超过理论所需量。实验中，取200μL的混合单糖标准液（各单糖浓度均为1mmol·L-1）加120μL 0.50mol·L-1的PMP甲醇溶液，控制PMP的量为混合单糖总量的60倍；然后分别加入30μL，60μL，90μL，120μL，200μL 的 0.25mol·L-1NaOH溶液，按“2.2”条件制备样品。色谱分析结果表明，NaOH溶液加入量为120μL时各种糖的PMP衍生产物的峰面积均为最大值，故确定NaOH溶液加入量为 120μL。

3.3 衍生化反应时间的选择

在其他条件（如“2.2”所述）相同情况下，将混合单糖标样分别采用 30min，60min，90min，120min 的反应时间进行衍生化反应，考察衍生化糖峰的峰面积大小变化。结果表明，反应时间为90min时，各种糖的PMP衍生产物的峰面积均为最大值，故衍生化反应时间选为90min。

3.4 中和温度的影响

由于在衍生化反应中PMP大大过量且在色谱分离中有一定的影响[2]，所以衍生反应完成后，需要用氯仿萃取去除过量的PMP。但糖的PMP衍生产物的化学结构中含有碱性基团，在pH值较高时不解离，因而易被氯仿萃取而损失，所以在萃取前应中和反应体系中的碱。在文献[7]中一般都采用冷却至室温。在实验进行中发现室温是一个很不确定的温度，比如夏季与冬季的室温差在20℃以上，这个差异导致了中和反应衍生化产物的不稳定，对样品分析和含量测定产生了很大的影响。因此，对静置冷却至室温（体系实测温度为32℃）与用冷水浴冷却10min（体系实测温度为12℃）两个中和温度条件进行了比较。实验结果表明，冷水浴冷却10min后中和的温度条件的色谱分析效果非常好，而室温冷却的色谱分析效果很差。主要表现在单糖衍生物峰面积大幅减小和死时间附近的有色物质峰面积大大增加。这是因为单糖衍生物不稳定，在较高温度条件下中和，由于酸的影响产生了部分衍生化不完全产物，导致单糖衍生物峰面积减小。这部分物质由于极性较强，所以不保留或保留较弱，峰出现在死时间附近。

3.5 酸度对萃取效果的影响

实验中考察比较了不同体积（120μL，150μL，180μL，210μL）的HCl（0.3mol·L-1）中和后的萃取效果。结果表明，使用120μL的盐酸中和即可，此时体系的pH值为5.64。萃取后大多数单糖PMP衍生物的峰面积较大，且5种糖衍生物的总的峰面积最大。实验结果表明，pH值（盐酸用量）对糖的PMP衍生物在萃取过程中的损失有一定的影响。pH值＞7，不利于单糖PMP衍生物的解离，因而在氯仿中有一定的溶解度，萃取中的损失较显著。pH值太低（＜4）也会增大单糖衍生物的损失，这是由于在酸性条件下衍生产物不太稳定所致。因此，应合理调节体系的pH值在5～6范围内。

3.6 萃取次数的影响

实验中采用2mL的氯仿进行萃取，对萃取次数进行了比较。结果表明，氯仿对PMP的萃取率较高，3次萃取后即可去掉99.0%的PMP。而对单糖衍生物的萃取影响不大，3次萃取后单糖衍生物的损失为3.50%。因此，确定萃取次数为3次。

3.7 检测线性及检出限

将5种单糖配制成一系列不同浓度的混合标样，分别按“2.2”衍生化，并在“2.4”所述条件下进样检测，以测得的各种糖的峰面积对相应浓度作工作曲线，结果见表1。

3.8 银耳多糖样品的单糖组成分析和方法重复性实验

在单糖组成分析中由于只需求得单糖间的摩尔比，并不需要知道各单糖的具体量。所以，在样品的分析中采用面积归一法计算。由于甘露糖在TPP2水解液中的浓度较大，为满足线性范围，采用稀释10倍后进行单独测定。根据分析和计算方法，求得TPP2中各单糖的组成摩尔比为甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖=77∶10∶3∶1∶15。甘露糖的 RSD （n=6）为2.13%；鼠李糖的RSD（n=6）为0.56%；葡萄糖的RSD（n=6）为 1.08%；半乳糖的 RSD（n=6）为 3.81%；木糖的 RSD（n=6）为 0.72%。

表1 银耳多糖TPP2的组成测定结果

4 结束语

对PMP衍生化方法进行了较系统深入的优化研究，考察了PMP与NaOH的用量、反应时间对反应的影响，确定了中和时反应体系的温度和盐酸用量。研究表明，反应体系在冷水浴（12℃）中冷却10min后，中和至微酸（pH 5.64）再进行萃取等操作，才会获得较好的色谱分离效果。建立了18%乙腈-磷酸盐缓冲液（20mmol·L-1、pH 6.72）为流动相等度 HPLC分析5种单糖的定性定量方法。利用该方法对TPP2的单糖组成进行了测定，求得TPP2中甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖的摩尔比为 77∶10∶3∶1∶15。与文献[2]比较，该方法的检测灵敏度大大提高，并弥补了不能分离检测葡萄糖和半乳糖的不足，可望推广用于其他多糖的单糖组成研究。

[1]颜 军，徐光域，郭晓强，等.银耳粗多糖的纯化及抗氧化活性研究[J].食品科学，2005，26（9）：169-172.

[2]颜 军，郭晓强，邬晓勇，等.非衍生化HPLC法分析银耳多糖中单糖组成的初步研究[J].食品科学，2007，28（7）：446-449.

[3]Meyer A，Raba C，Fischer K.Ion-pair RP-HPLC determination of sugars，amino sugars,and uronic acids after derivatization with p-aminobenzoic acid[J].Anal.Chem.，2001（73）：2377-2382.

[4]张艳萍，俞远志，张 虹.气相色谱分析生地黄多糖的单糖组成及其含量[J].中国中药杂志，2009，34（4）：419-422.

[5]张 威，何红波，张 明，等.糖腈乙酰酯衍生气相色谱法测定土壤水解性单糖[J].土壤通报，2008，39（4）：913-916.

[6]颜 军，郭晓强，李晓光，等.TLC快速分析多糖的单糖组成[J].食品科学，2006，27（12）：603-607.

[7]马定远，陈 君，李 萍，等.柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成[J].分析化学，2002，30（6）：702-705.

Analysis of monosaccharide com positions in tremella polysaccharides by pre-column derivatization high performance liquid chromatography

YAN Jun1，2，HOU Xian-deng1，XU Kai-lai1
（1.College of Chemistry，Sichuan University，Chengdu 610064，China；2.Laboratory for Chemistry of Traditional Chinese Medicine，Chengdu University，Chengdu 610106，China）

A method of PMP pre-column derivatization high performance liquid chromatographic was established for analysis of five kind of monosaccharide.The optimum conditions of derivatization were determined by studying the quantity of PMP and sodium hydroxide，reaction time，reaction temperature and hydrochloric acid consumption during neutralization.Under the optimum mobile phase which was 18%acetonitrile-phosphate buffer（20mmol·L-1，pH 6.72），PMP derivatives can be separated successfully.This method was applied to monosaccharide compositions analysis of tremella polysaccharide（TPP2）.

monosaccharide；polysaccharide；HPLC；PMP

S567.3+4；TS247

A

1674-5124（2011）01-0044-03

2010-04-20；

2010-08-03

四川省中医药管理局科技专项资助项目（2008-01）

颜 军（1971-），男，四川成都市人，高级实验师，主要从事生物活性成分的分离与检测工作。