牛蒡多酚的分离纯化及清除DPPH自由基的研究

滕道祥, 马利华, 秦卫东

(1.徐州工程学院 数理学院,江苏 徐州 221008;2.徐州工程学院 食品学院,江苏 徐州 221008)

自由基是生物体内有关酶促系统需氧代谢过程和电子传递链中电子传递的中间产物,是生物体组织或细胞经历某些病理损害过程的中间产物。生物体内自由基的产生、体内自身清除系统的活力或药物清除作用的发挥与疾病的发生、发展和转归有直接关系,因此从自由基清除、抗氧化方面探讨食品清除自由基、增强抗氧化的活性,开发、研制一些新型天然抗氧化剂已受到国内外学者的广泛关注[1]。

植物多酚是一类广泛存在于植物体内的多酚类物质,是植物的次生代谢产物,具有清除机体内自由基、抗脂质氧化、延缓机体衰老、预防心血管疾病、防癌、抗辐射等生物活性功能[2,3],因此,开发和利用植物多酚具有重要意义。牛蒡系菊科牛蒡属植物,学名Arctum Iappa L,是民间传统的药用植物,含有丰富的多糖、多酚等具有生物活性的物质,营养价值高,具有清除体内垃圾、促进细胞活性、延缓衰老的作用,是徐州地区出口创汇主要特种保健型蔬菜之一[4]。

本实验以牛蒡为原料,提取多酚物质,采用大孔树脂层析法对牛蒡多酚进行纯化,并利用EPR技术,检测牛蒡多酚清除DPPH自由基能力,以期开发一种具有良好生理活性的新的植物多酚材料,同时为拓展牛蒡深加工产品领域、综合利用牛蒡资源提供一条有效途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料

牛蒡(市售);大孔树脂 NKA-9、S-8、AB-8、D2040(南开大学化工厂);铁氰化钾、三氯乙酸、水杨酸、95%乙醇,为分析纯。

1.2 仪器与设备

JES-FA200电子自旋共振仪及配套设备:石英标准样品管(内径为4 mm),微波发生器,Data Process,均购置于日本JEOL公司;DHG-9140电热恒温鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司);FZ102微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);7230G可见分光光度计、FA2104N电子天平(上海精密科学仪器有限公司);PC-1000电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)。

1.3 方 法

1.3.1 牛蒡多酚的提取

称取10 g自制牛蒡粉,加入120 mL 70%乙醇,在90℃水浴锅中回流提取40 min,抽滤后得质量浓度为0.560 2 mg/mL溶液,备用。

1.3.2 大孔树脂的预处理

大孔树脂经乙醇、5%NaOH溶液冲洗、乙醇浸泡、5%的HCl冲洗及蒸馏水冲洗至中性。

1.3.3 牛蒡多酚的分离纯化

(1)静态吸附。准确称取相当于6 g干重预处理过的大孔树脂 NKA-9、S-8、AB-8、D2040的湿树脂,放入烧杯中,加入牛蒡粗提液,定期测定液体的吸光度,直至吸光度值保持不变,测定其吸附量、吸附率、解吸附率[5],计算公式为:

其中,ρ0、ρ分别为吸附前、后溶液中牛蒡多酚的质量浓度;V为提取液的体积;m为树脂质量。

其中,V为洗脱剂总体积;ρ为洗脱液中牛蒡多酚的质量浓度;m为静态吸附总量。

(2)动态吸附。将树脂活化后,称取40 g,装入2.0×40.0 cm柱。待树脂柱平衡后,加入多酚提取液80 mL,按照一定的流速分别进行动态吸附,收集流出液并测定其吸光度,计算吸附量为:

其中,ρ0为上柱前料液中牛蒡多酚质量浓度;ρ为流出液中牛蒡多酚质量浓度;V为流出液总体积;m为树脂质量。

(3)流速对吸附效果的影响。称取活化后的树脂装柱,提取液以不同的流速进行动态吸附,收集流出液并测定其吸光度、计算吸附量,考察流速对树脂吸附效果的影响。

(4)提取液质量浓度对吸附效果的影响。称取活化后的树脂装柱,以不同质量浓度的提取液按照1 mL/min的流速进行动态吸附,收集流出液并测定其吸光度,计算吸附量,考察提取液质量浓度对树脂吸附效果的影响。

(5)动态解吸附实验。动态解吸附率是指用洗脱剂对吸附后的大孔树脂进行动态解吸附时,洗脱剂解吸附出被吸附物质的质量与被吸附物质的总质量之比,即:

其中,V为洗脱剂总体积;ρ为洗脱流出液中牛蒡多酚质量浓度;m为动态吸附量。

(6)洗脱速度对纯化效果的影响。称取活化后的树脂装柱,解吸附速度分别为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL/min 进行解吸附 ,解吸附平衡时分别记下洗脱剂用量,计算其解吸附率。

(7)洗脱剂体积分数对纯化效果的影响。以2 mL/min速度,分别用 30%、60%、70%、80%、95%乙醇进行洗脱,计算其解吸附率。

1.3.4 牛蒡中多酚测定

分别移取不同预处理物料的提取液1.00 mL置于容量瓶中,各加入1 mol/L NaAc和1 mol/L HAc(体积比 3∶1)溶液 3 mL,再加0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL,95%乙醇稀释至25 mL,放置20 min,在430 nm波长下测定吸光度。

提取率=提取液质量浓度×稀释倍数×(提取液体积/测定时使用体积)/原料质量。

1.3.5 DPPH体系制备

称取0.012 8 g DPPH加水溶解于小烧杯中,移至50 mL容量瓶,定容,摇匀。将牛蒡多酚溶液稀释 100 倍后,分别取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL牛蒡多酚溶液,按表 1所列方式加样。

表1 DPPH自由基实验加样表

样品对DPPH自由基的清除能力(scavenging activity,简称SA)可表示为:

其中,A0、Ai、Aj表示体系中各种加样 EPR谱信号强度测量的平均值。

以上3种试剂各取5 μ L打入 EP管,混匀后立即装入石英毛细管中,然后外加样品保护测试管,一并放入EPR波谱仪的谐振腔中进行测定,在此之前应将空样品管放入谐振腔中检测有无杂质信号,根据计算机显示的谱线来旋转调整样品位置,位置选好之后,调整参数进行测量[7]。

1.3.6 半清除率(EC50)的测定

半清除率指清除率为50%时所需样品的质量浓度,根据不同质量浓度样品的清除率作曲线求出。所需质量浓度越低,半清除率越高,表明该物质抗氧化性能越好[8]。

问卷调查共4道题，分值计量采取1-5分，采用独立样本T检验进行了统计。第一道题调查实验对象的词汇学习频率，因为频率是词汇习得率的一个关键因素，重复频率越高，习得率越高。调查问卷问题和数据分析结果如下（表4）

1.3.7 EPR测试条件

扫描时间2 min;中心磁场321.0 mT;扫描宽度50 mT;微波频率9 044.613 MHz;微波功率20 mW;g 2.011。

2 结果与分析

2.1 静态吸附试验结果

用 NKA-9 、S-8、AB-8、D2040 树脂经预处理后,分别称取5 g放在100 mL烧杯中,分别加入50 mL提取液,达到吸附平衡后,计算饱和吸附量和吸附率。将已处理好的树脂经静态饱和吸附后滤出,加入70%乙醇50 mL,达到静态洗脱平衡,测定洗脱液的体积分数,计算解吸附率,其结果见表2所列。由表2可看出,4种树脂中AB-8树脂为最佳的吸附分离载体。

表2 4种树脂静态吸附、解吸附性能

2.2 动态吸附

2.2.1 动态吸附流速的确定

称取经预处理的AB-8树脂装柱、装入浓缩液,控制流速在 0.5、1.0、1.5 、2.0、2.5 mL/min上柱吸附,考察上柱流速对吸附牛蒡多酚的影响,结果如图1所示。实验结果表明,上柱流速为1.0 mL/min时牛蒡多酚吸附量最大。

图1 流速对吸附牛蒡多酚的影响

2.2.2 提取液质量浓度对吸附效果的影响

以不同质量浓度的提取液,以1 mL/min的流速进入AB-8树脂柱中进行吸附试验,收集流出液,测定其吸光度,考察上样质量浓度对吸附效果的影响,结果如图2所示。

图2 上柱液质量浓度对吸附效果的影响

由图2可看出,上柱液中牛蒡多酚的质量浓度越高,树脂处理的溶液量就越小,吸附效果就越差。AB-8吸附树脂的吸附量在上样初始质量浓度为1.68 mg/mL时吸附量最大。

2.3 动态解吸附实验

2.3.1 解吸附速度对解吸附效果的影响

解吸附速度分别为 1.0、1.5 、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL/min时进行解吸附,计算解吸附率如图3所示。由图3可以看出,以AB-8树脂动态解吸附牛蒡多酚时,解吸附速度应控制在2 mL/min相对较好。

图3 解吸附速度对AB-8树脂解吸附效果的影响

2.3.2 乙醇体积分数对解吸附效果的影响

分别以 50%、60%、70%、80%、90%的乙醇为洗脱液,按2 mL/min进行解吸附,计算解吸附率,考察乙醇体积分数对解吸附效果的影响如图4所示。由图4可看出,在乙醇体积分数为50%～70%时,解吸附率随着乙醇体积分数的升高而升高,但体积分数大于70%时就随其体积分数的增加而下降。因此,乙醇溶液体积分数为70%时,对牛蒡多酚的解吸附效果最好。

图4 乙醇溶液体积分数对解吸附效果的影响

2.4 纯化效果

称取经预处理的AB-8树脂装柱、装入浓缩液,采用初始质量浓度为1.68 mg/mL上样,以流速1.0 mL/min吸附,吸附完毕后,以70%乙醇溶液解吸附,速度2.0 mL/min,将牛蒡多酚提取液纯化,测定纯化前与纯化后牛蒡多酚提取液中多酚的质量浓度,比较纯化的效果,如图5所示。

图5 纯化效果的比较

由图5看出,大孔树脂纯化效果明显,牛蒡提取液经过大孔树脂纯化后,牛蒡多酚质量浓度提高了55.36%。

2.5 EPR测定牛蒡多酚清除DPPH自由基

分别取不同体积纯化前后的牛蒡多酚溶液各5 μ L打入EP管,与DPPH 自由基溶液混匀后立即装入石英毛细管中,放入EPR波谱仪的谐振腔中进行测定,结果如图6所示。图6表明,纯化前后,随着牛蒡多酚质量浓度的提高,DPPH自由基在EPR图谱中谱信号强度均逐渐降低,说明牛蒡多酚对DPPH自由基有一定的清除效果。

图6 牛蒡多酚清除DPPH自由基EP R图谱

纯化前后质量浓度为56～336 μ g/mL时,随着牛蒡多酚质量浓度的增加,DPPH自由基的清除率均在不断提高,且呈现一定的线性关系,如图7所示。其线性方程为:

图7 不同质量浓度牛蒡多酚与清除率的关系

通过计算,半数清除率(EC50)纯化前为202.04 μ g/mL,纯化后为 154.73 μ g/mL,纯化前后EC50的比较如图8所示。从图8可看出,清除率降低了23.42%,其抗氧化能力明显提高了。

图8 纯化前后EC50的比较

3 结束语

大孔树脂AB-8为牛蒡多酚纯化的最佳处理树脂。最佳纯化条件如下:上柱流速为1.0 mL/min、上样初始质量浓度为1.68 mg/mL时吸附量最大;70%乙醇为最佳洗脱剂,以2.0 mL/min速度解吸附效果最好,纯化后牛蒡多酚的质量浓度提高了55.36%。

本实验的研究表明,大孔树脂再生后可反复利用,工艺简单,成本低,适用于工业化大生产[2],牛蒡经过大孔树脂处理后,多酚物质的质量浓度以及抗氧化能力均有所提高。且EPR技术具有灵敏度高、样品不受破坏和无干扰等优点,适用于增抑自由基能力的研究[9]。

[1]庞战军,周 玫,陈 瑗.自由基医学研究方法[M].北京:人民卫生出版社,2000:5.

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