高效液相色谱法同时测定清浊祛毒丸中咖啡酸、虎杖苷、丹皮酚含量

黎 强，张晓娟，钟明利

(1.广西壮族自治区玉林食品药品检验所，广西 玉林 537000; 2.广西桂林医学院，广西 桂林 541004)

高效液相色谱法同时测定清浊祛毒丸中咖啡酸、虎杖苷、丹皮酚含量

黎 强1，张晓娟1，钟明利2

(1.广西壮族自治区玉林食品药品检验所，广西 玉林 537000; 2.广西桂林医学院，广西 桂林 541004)

目的建立同时测定清浊祛毒丸中咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量的高效液相色谱法。方法采用Agilent Eclipse XDB－C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，用甲醇 －0.1%磷酸流动相进行梯度洗脱，流速 1.0 mL/min，检测波长 314 nm，进样量 5 μL。结果咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚质量浓度线性范围分别是 4.8 ～96.0 μg/mL(r=0.999 5， n=5)，4.1 ～82.0 μg/mL(r=1.0， n=5)和 12.0 ～240.0 μg/mL(r=0.999 9，n=5)，平均加样回收率分别为 101.10%(RSD=1.6% ，n=9)，101.62%(RSD=0.8% ，n=9)，102.71%(RSD=1.2% ，n=9)。结论该法方便、快捷、准确、灵敏、重现性好，能更全面地控制清浊祛毒丸的质量。

清浊祛毒丸;咖啡酸;虎杖苷;丹皮酚;高效液相色谱;含量

The linear ranges of caffeic acid，polydatin and paeonol were 4.8 － 96.0 μg/mL(r=0.999 5， n=5)，4.1 － 82.0 μg/mL(r=1.0， n=5)and 12.0 － 240.0 μg/mL(r=0.999 9， n=5)，respectively.The average recovery rates were 101.62% (RSD=0.8% ， n=9)for polydatin，101.10% (RSD=1.6% ， n=9)for caffeic acid and 102.71%(RSD=1.2% ， n=9)for paeonol respectively.Conclusion The method is simple，rapid，accurate and sensitive with good reproducibility，which is suitable for fully controlling the quality of Qingzuoqudu Pills.Key words:Qingzhuoqudu pills;caffeic acid;polydatin;paeonol;HPLC;content determination

清浊祛毒丸由蒲公英、牡丹皮、虎杖、地黄、山茱萸等12味中药制成，能清热解毒、利湿祛暑，用于治疗湿热下注所致尿频、尿急、尿痛等。现行标准中其质量控制方法为用紫外分光光度法测定丹皮酚的含量[1]，但该法操作较为烦琐。本试验用高效液相色谱(HPLC)法同时测定清浊祛毒丸的咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量，能更全面地控制清浊祛毒丸的质量。

1 仪器与试药

1100 Series高效液相色谱仪(安捷伦);TU－1221型紫外－可见分光光度计(北京普析通用);AE240型电子分析天平(梅特勒－托利多);SB2200型超声清洗器(上海必能信超声有限公司)。对照品咖啡酸(批号为 885－200001)，虎杖苷(批号为 111575－200301);丹皮酚(批号为0780－9704)，均由中国药品生物制品检定所提供;甲醇、磷酸(色谱纯)，一级纯化水;清浊祛毒丸(批号为081102，090701，090801，090504，广西玉林大清药业有限公司);大血藤、蒲公英、牡丹皮、虎杖、地黄、山茱萸等12味药材(市售品)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为 AgilentEclipse XDB －C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以甲醇为流动相 A，0.1% 磷酸为流动相B，按表1进行梯度洗脱，流速为 1.0 mL/min，检测波长为314 nm，柱温40℃，进样量5 μL。在上述色谱条件下，3个组分峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按咖啡酸、虎杖

表1 梯度洗脱条件

2.2 溶液制备

取清浊祛毒丸10袋，研成粉末，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理45 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，残渣再加10 mL甲醇，称定质量，超声处理10 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，合并滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液即为供试品溶液。另分别取咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚对照品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，制成质量浓度分别为 0.143 4，0.515 6和1.840 8 g/L的对照品贮备液以及质量浓度为咖啡酸4.11 mg/mL、虎杖苷4.8 mg/mL及丹皮酚1.2 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性对照试验:取按处方制备的分别不含蒲公英、虎杖和牡丹皮原药材的样品，按供试品溶液制备方法制备溶液试验。结果在咖啡酸、虎杖苷及丹皮酚的对应峰位上未出现色谱峰，说明阴性对照品溶液对测定无干扰(见图1)。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:分别精密吸取混合对照品贮备液(咖啡酸4.11 mg/mL、虎杖苷 4.8 mg/mL，丹皮酚 1.2 mg/mL)0.1，0.2，0.4，1.0，2.0 mL，置 10 mL 量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列质量浓度的对照品混合溶液，进样测定峰面积，以对照品质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线回归方程见表2。

表2 线性关系考察结果

精密度试验:将混合对照品贮备液稀释10倍，重复进样5次测定。结果峰面积、咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚峰面积的 RSD分别为 0.8% ，0.2%，0.3%(n=5)。

稳定性试验:取同一供试品溶液，在室温避光条件下，分别于0，2，4，8，12，24 h 时进样，考察保留时间及峰面积的一致性。测得样品中咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚峰面积的 RSD分别为1.4%，1.5% ，1.6%(n=6)。

重复性试验:取同一批(批号为081102)清浊祛毒丸样品，平行制备6份供试品溶液，进样分析。结果咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量的平均值分别为 0.167 9，0.847 3，2.209 0 mg/g，RSD 分别为2.2% ，1.7%，2.3%。

加样回收试验:分别取已知含量的样品(批号为081102)9份，每份约 1.0 g，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液 1.0，1.5，2.0 mL，每一浓度制备3份，挥干溶剂后测定各成分的含量并计算回收率。咖啡酸、虎杖苷及丹皮酚的平均回收率为101.1%，101.6%，102.7%，RSD 分别为 1.6% ，0.8%，1.2%(n=9)。

2.4 样品含量测定

另取3批样品，依法制备供试品溶液，进样测定峰面积以外标法计算咖啡酸。虎杖苷及丹皮酚含量结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

虎杖苷又名白藜芦醇苷，具有抗癌、抗菌消炎、抗氧化等生物学作用[2]，因其属于二苯乙烯类化合物，在光照条件下不稳定，容易向其异构体或衍生物转化，导致含量降低，故须避光操作[3]。

取适当浓度的咖啡酸、虎杖苷及丹皮酚对照品溶液，在波长200～400 nm范围内做吸收光谱扫描，结果咖啡酸在323和217 nm波长处有最大吸收，虎杖苷在307和217 nm波长处有最大吸收，丹皮酚在314，274，228和213 nm波长处有最大吸收。经比对，各成分在314 nm波长处吸收较好，故最后选择314 nm为测定波长。

在色谱条件筛选试验中，对流动相比例及酸度、梯度洗脱时间、柱温以及进样量做了考察，结果以本试验的色谱条件为最佳。

提取方法[4－6]选择时，样品中咖啡酸的含量较少，故需要加大取样量。考察了甲醇、50%甲醇、乙醇等溶剂，发现甲醇的提取效率最高。而提取方法以超声提取效果最好，并且二次超声提取效率最高。故确定提取方法为超声处理45 min，过滤后残渣再加10 mL甲醇超声处理10 min，合并滤液。

[1]WS－10279(ZD －0279)－2002，国家药品标准(试行)[S].

[2]刘树兴，程丽英.虎杖有效成分的开发现状及展望[J].食品科技，2005(2):96－98.

[3]马丽艳，刘彦雷，梁学军，等.贮藏条件对葡萄酒中白藜芦醇的影响[J].中外葡萄与葡萄酒，2005(6):9.

[4]曾秋华，刘文京，唐晓晖.高效液相色谱法测定蒲公英颗粒中咖啡酸含量[J].中国药业，2007，l6(3):26.

[5]周丹丹，赵云丽，张 艳，等.RP－HPLC法同时测定乙肝舒康胶囊中虎杖苷和二苯乙烯苷含量[J].药物分析杂志，2008，28(3):411.

[6]张翠英，李忠保，李振国，等.HPLC测定六昧地黄颗粒中马钱苷和丹皮酚含量[J].中成药，2008，30(12):1 791 －1 794.

Simultaneous Determination of Caffeic Acid，Polydatin and Paeonol in Qingzhuoqudu Pills by HPLC

Li Qiang1， Zhang Xiaojuan1， Zhong Mingli2
(1.Yulin Institute for Food and Drug Control， Yulin， Guangxi， China 537000; 2.Guilin Medical College， Guilin， Guangxi， China 541004)

ObjectiveTo establish a HPLC method for simultaneous determination of caffeic acid，polydatin and paeonol in Qingzhuoqudu Pills.Methods The Agilent Eclipse XDB － C18column(250 mm ×4.6 mm，5 μm)was used with the mobile phase of methanol－0.1%phosphoric acid.The flow rate was 1.0 mL/min and the UV detection wavelength was set at 314 nm.The sample size was 5 μL.Results

R284.1;R286.0

A

1006－4931(2011)10－0038－02

2010－03－12)