灭幽汤对幽门螺杆菌感染性胃炎小鼠胃组织IKKβ表达的影响

施花锦 ，王小娟 ，伍参荣 ，郭建生 ，夏 历 ，刘 羽

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

灭幽汤对幽门螺杆菌感染性胃炎小鼠胃组织IKKβ表达的影响

施花锦1，王小娟2*，伍参荣1，郭建生1，夏 历2，刘 羽1

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

目的 探讨IκB分子的上游蛋白激酶（IKKβ）在幽门螺杆菌相关性胃炎（HAG）病理变化的可能作用机制及灭幽汤的影响效应。方法 建立HAG模型，将造模成功的小鼠按体质量随机分为模型组、丽珠得乐组，灭幽汤组。采用免疫组化法检测胃黏膜组织中核转录因子(NF-κB)、IKKβ的蛋白表达情况。HE染色观察胃组织病理变化。结果 灭幽汤组能明显减轻胃组织的炎症反应，灭幽汤组胃黏膜炎症程度低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；能抑制HAG胃组织中NF-κB、IKKβ蛋白的活性，灭幽汤组NF-κB、IKKβ表达强度明显低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NF-κB和IKKβ在HAG的炎症反应中发挥重要的作用，灭幽汤治疗HAG的可能作用机制是通过抑制IKKβ的激活，阻止其活化。

灭幽汤；幽门螺杆菌；胃炎；核转录因子；IκB分子的上游蛋白激酶；小鼠；黄芩；蒲公英；乌贼骨

幽门螺杆菌相关性胃炎（Helicobacter pyloriassociated gastritis，HAG）仍是目前消化系统的顽疾之一，H.pylori的致病机理尚不明确。因此，进一步阐明HP相关性胃病的发病机制，开拓新的治疗途径是医学界亟待解决的重要课题。近年来对NF-κB激活的信号通道研究较多，研究发现IKKβ是NF-κB信号途径的关键成员，IKK的作用是结合并将IκB磷酸化，使NF-κB能入核。灭幽汤是临床治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的有效复方，本研究从NF-κB、IKKβ的角度出发，探讨灭幽汤对HAG的治疗作用及可能的作用机制。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级雄性昆明小鼠50只，体质量（25±5）g，由湖南省长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供，动物合格证号：SCXK(湘)2006-0001。

1.1.2 药物 灭幽汤（由黄芩、蒲公英、青皮、陈皮、三七、白及，乌贼骨等药组成）由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供，将中药浸泡30 min后用武火煎煮3次，浓缩至含生药2 g/mL，高温灭菌后保存备用。丽珠得乐，由丽珠集团丽珠药厂生产（批号：国药准字，H10900086）。

1.1.3 试剂 快速尿激酶检测试剂购自福建三强生物有限公司。免疫组化NF-κB、IKKβ和IL-8一抗、二抗及SABC,购自武汉博士德生物有限公司。

1.1.4 仪器 SHANDON-AS325切片机（上海科技大学仪器）；Y-I6生物组织摊烤片机（湖北孝感亚光医用电子技术研究所）；Olympus双目生物显微镜（日本Olympus公司产品）。

1.2 方法

1.2.1 动物造模及分组 取昆明小鼠50只适应性饲养1周后按体质量均匀分组：正常对照组10只，造模组30只。根据预实验结果[1]，采用HP菌液灌胃法建立幽门螺杆菌感染动物模型，除空白对照组外其他动物实验组小鼠第1天经禁食24 h后,用胃管灌胃50%乙醇0.2 mL/只，1 h后灌胃给以Hp菌株(109CFU/mL，0.5 mL)；实验在第 3、5、7、9 天重复上述操作。 于全部接种结束后第5天，分为灭幽汤组10只、丽珠得乐组10只，分别给予灭幽汤和丽珠得乐，用药14 d，模型组、正常组分别给予等量的生理盐水。

1.2.2 给药方法及剂量 灭幽汤组按33.79 g/kg灌服灭幽汤煎液，丽珠得乐20 mg/kg，给药剂量均按60 kg成人体表面积计算，相当成人用量的4倍，空白组和模型组灌胃生理盐水15 mL/kg每日1次，连续用药2周。

1.2.3 胃黏膜病理组织学检测 采用HE染色法观察小鼠胃黏膜炎症程度，炎症程度分级参照人胃炎的分类法，均属于慢性浅表性胃炎,根据炎细胞的数量及浸润胃壁的深度分为3级并记分:无炎症0分,轻度炎症1分,中度炎症2分,重度炎症3分。

1.2.4 NF-κB、IKKβ的蛋白表达 采用免疫组化法检测（操作方法参考相关试剂盒说明书）。采用病理图像分析系统对免疫组化染色切片进行图像分析，每张切片随机选择10个视野，在高倍镜下计算其平均光密度（OD）求其平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 对各组小鼠一般情况观察

模型组小鼠体毛缺乏光泽，精神不振，活动迟缓，其余各组小鼠情况良好，各组小鼠体质量和摄食情况无明显变化。

2.2 对小鼠胃黏膜病理组织学的影响

光镜下，正常组小鼠胃黏膜上皮完整，固有层内有密集排列的腺体，大鼠胃黏膜底部可见极少量散在淋巴细胞。模型组大鼠胃窦部的炎症程度较重，固有层内可见较多的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞浸润。各治疗组动物的炎症均较模型组有所减轻，差异有统计学意义(P<0.05)。表1可见给药组的急性炎症及慢性炎症评分明显下降。

表1 对各组小鼠胃窦部黏膜病理组织学的影响（n=10，）

表1 对各组小鼠胃窦部黏膜病理组织学的影响（n=10，）

注：与模型组比较*P<0.05；与丽珠得乐组比较★P>0.05。

组 别正常组模型组灭幽汤组丽珠得乐组剂量（g/kg）— —0.034 0.128胃黏膜慢性炎症0.19±0.39*1.56±0.36 0.26±0.34*★0.48±0.34*胃黏膜急性炎症0 1.38±0.42 0.20±0.40*★0.32±0.42*

2.3 对各组小鼠胃黏膜组织IKKβ和NF-κB表达的影响

正常对照组小鼠胃黏膜组织细胞内均有少量IKKβ、NF-κB表达。与正常比较,模型组小鼠胃黏膜IKKβ及NF-κB表达增加,差异有统计学意义 (P<0.05)；与模型组比较,灭幽汤组小鼠胃黏膜IKKβ及NF-κB表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)；与丽珠得乐组比较，灭幽汤组小鼠胃粘膜IKKβ及NF-κB表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4 免疫组化NF-κB、IKKβ的蛋白表达

正常组胃黏膜组织细胞胞浆内有少量NF-κB、IKKβ蛋白棕色颗粒状阳性反应物，模型组胃粘膜组织细胞胞浆内有NF-κB、IKKβ蛋白棕色颗粒状强阳性反应物，灭幽汤组胃黏膜组织细胞胞浆NF-κB、IKKβ蛋白棕色颗粒状阳性反应物明显减少，丽珠得乐组：胃黏膜组织细胞胞浆内有中等量NF-κB、IKKβ蛋白棕色颗粒状阳性反应物，见图1～2。

表2 各组小鼠胃黏膜组织IKKβ和NF-κB 蛋白表达情况 （n=10，，OD）

表2 各组小鼠胃黏膜组织IKKβ和NF-κB 蛋白表达情况 （n=10，，OD）

注：与模型组比较*P＜0.05；与丽珠得乐组比较★P＞0.05。

组 别 剂量（g/kg）NF-κBIKKβ正常组 — 0.125±0.086*0.068±0.042*模型组 —0.235±0.0880.251±0.078灭幽汤组0.1280.150±0.042*★0.126±0.120*★丽珠得乐组0.0340.137±0.076*0.104±0.074*

图2 胃黏膜组织细胞中IKKβ的蛋白表达光镜图（免疫组化×200）

3 讨论

NF-κB是细胞活化和产生细胞因子的重要转录调控因子。在静止细胞胞液中,NF-κB与IκB(κB的抑制剂)结合,处于失活状态。细胞活化传递的信号激活 IκB 激酶(IKK),IKK 催化 IκBα(Ser32、Ser36)和IκBβ(Ser19、Ser32)磷酸化,使 IκB 与 NF-κB 解离后被降解,于是NF-κB进入核内,调节多种基因转录[2]。当受到某些细胞因子（如肿瘤坏死因子、白介素-1、白介素-8等）、脂多糖（LPS）、细菌及病毒产物及一些氧化剂等细胞外信号刺激时，刺激信号借受体将信号传递至胞浆，先激活IκB激酶（IKK）的上游激酶而促使IKK活化，活化的IKK可使IκBαN端调节区的两个丝氨酸残基scr32/36磷酸化，继而泛素化，再经26S蛋白酶小体降解，这时NF-κB二聚体从NF-κB/IκB α三聚体复合物释放，发生核转位从胞浆进入细胞核，与其靶基因中启动子或增强子的κB基因序列结合从而启动下游基因转录，发挥其生物学作用。最新的研究发现,IKK-β是I-κB磷酸化激酶,它诱导 I-κB 磷酸化,使 NF-κB/I-κB 二聚体解离,暴露NF-κB的核定位片段是NF-κB活化和移位的前提[3-6]。本研究采用免疫组化法来反映机体受到外界刺激时导致NF-κB活化的上游激酶IKK-β的激活水平。

灭幽汤方中以清热利湿、理气和胃立法，结合多年的临床经验组方而成。方以黄芩、蒲公英清热燥湿解毒为君，以除脾胃之湿热；青皮、陈皮行肝脾气滞以疏通气机；佐以三七、白及，既活血化瘀助青皮、陈皮协调气血之运行，又收敛生肌修复局部之病灶；重用乌贼骨制酸止痛而为之使。现代研究表明：清热解毒中药能够改善胃黏膜炎症细胞浸润，黄芩、蒲公英能抗多种病原微生物，对多种球菌和杆菌有杀灭作用；白及祛腐生肌可修复糜烂的胃黏膜；乌贼骨含有丰富碳酸盐和磷酸盐能改变胃的酸性内环境，抑制HP的生长；三七活血化瘀止痛、消炎生肌，能促进血液循环消除组织水肿，促进黏膜增生，加快修复，临床研究显示本方对HAG患者具有较好的疗效。这些药物直接或间接的抗炎作用可能是本方改善胃黏膜炎症的基础。

本研究结果显示，幽门螺杆菌感染性胃炎小鼠给予灭幽汤治疗后，小鼠的胃黏膜组织黏膜炎症部位NF-κB表达、炎症细胞密度均显著减低。IKK-β在模型组中的表达明显高于正常组，说明其在HAG病理生理反应和组织器官损害中发挥重要作用,经灭幽汤干预后的IKK-β表达减少，灭幽汤可能通过抑制IKK-β的激活,阻断NF-κB的活化，从而缓解了HAG的进一步发生和发展，起到治疗的作用。

[1]张荣光，段广才.幽门螺杆菌感染的昆明小鼠模型的建立[J].中华医学杂志，2006，86（12）：857-859.

[2]May M J.Science[M].1999,284:271-272.

[3]Kwok B H,Koh B,Ndubuisi M I,et al.The anti-inflammatory natural product parthenolide from the medicinal herb Feverfew directly binds to and inhibits IκB kinase[J].Chem Biol,2001,8(8):759-766.

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[5]Senftleben Uwe,Karin Michael.The IKK/NF-κB pathway[J].Crit Care Med,2002,30(1Suppl):S18-26.

[6]Huber Margit A,Denk Andrea,Peter RalfU,et al.The IKK-2/κBα/NF-κB pathway plays a key role in the regulation of CCR3 and eotaxin-1 in fibroblasts.A critical link to dermatitis in IκBαdeficient mice[J].J Biol Chem,2002,277(2):1 268-1 275.

（本文编辑 彭芝配）

Effect of Mieyou decoction on expression of IKKβ in gastric tissue of Helicobacter pylori-associated gastritis in mice

SHI Hua-jin,WANG Xiao-juan,WU Can-rong,GUO Jian-sheng,XIA Li,LIU Yu
(TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To discuss the effects of Mieyou decoction on IKKβ in Helicobacter pylori-associated gastritis(HAG)and its possible mechanisms on pathological changes.Methods After HAG models were established,the mice were randomly divided into model,Cabernet Franc Sidel and Mieyou decoction groups according to the weight.The expression of NF-κB and IKKβ protein in gastric mucosa tissue were detected with immunohistochemical and gastric tissue pathological changes with HE staining. Results The mucosal inflammation in Mieyou decoction group was significantly lighter than that in model control group(P<0.05);inhibit the activities of NF-κB and IKKβ,the expression intensity of NF-κB and IKKβ was lower than that in model group(P<0.05).Conclusion NF-κB and IKKβ play an important role in HAG inflammation,and the possible mechanism of Mieyou decoction is to inhibit activation of IKKβ to prevent activation of NF-κB.

Mieyou decoction;Helicobacter pylori;gastritis;IKKβ;NF-κB； mice；Scutellaria； Dandelion； cuttlefish bone

*王小娟，E-mail:shihuajin83@163.com。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.009.033.03

2010－11－26

湖南省自然科学基金项目（06JJ4038）；湖南省教育厅资助科研项目（07c496）。

施花锦（1983-），女，江西宜春人，硕士研究生，研究方向消化系统疾病。