精索静脉曲张对青春期大鼠性激素以及其睾丸受体的影响

李超鹏 ，张 端 ，史婷婷 ，张雁钢 ⋆

1.山西医科大学第一医院泌尿外科，山西太原 030001；2.山西医科大学第一医院药理学教研室，山西太原 030001

精索静脉曲张（varicocele，VC）是青壮年男性常见的疾病，是因精索静脉血流淤积而造成精索蔓状丛（静脉血管丛）血管扩张、迂曲变长。发病率男性人群为10%～15%，以左侧发病为多。Trussell等[1]研究发现，77.5%的不育患者有不同程度的双侧精索静脉曲张，15.5%的患者伴有单侧精索静脉曲张。VC可伴有睾丸萎缩、精子生成障碍和精液异常。有明确的证据表明VC对睾丸的损害随时间进展而累积，并最终导致不育的发生[2]。Boucher等[3]研究发现伴有精索静脉曲张的不育患者精子发生和间质细胞功能障碍并伴有垂体功能亢进。对于VC引起不育的机制的研究主要集中在阴囊高温、代谢产物反流、下丘脑-垂体轴功能不足、睾丸局部缺氧、DNA损伤等方面[4]。本研究通过建立青春期大鼠实验性左侧精索静脉曲张（experimental left varicocele，EV）模型，探讨 VC对大鼠性激素及其受体的影响，揭示性激素及性腺轴功能障碍对大鼠生精功能的可能影响，为VC导致不育的机制研究提供实验资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

大鼠的青春期通常为（50±10）d，选择鼠龄6周、体重110～130 g的Wistar雄性大鼠作为青春期大鼠，由山西医科大学生理教研室动物房提供。

1.2 动物模型的建立及实验分组

10%水合氯醛腹腔注射麻醉，部分结扎左肾静脉。具体方法如下：取腹部正中切口，游离左肾静脉，在左肾上腺静脉和睾丸静脉内侧、肾静脉汇入下腔静脉处，置一根直径为0.55 mm的金属杆，与左肾静脉一起结扎，借此使左肾静脉直径缩小约1/2。结扎后将金属杆拔出，可见部分结扎的左肾静脉迅速扩张。3-0丝线缝合切口。对照组游离左肾静脉，但不结扎。

实验分组：共对18只大鼠进行左肾静脉结扎手术，随机分为三组，每组各6只，术后2、4、8周均检测血清性激素及取睾丸组织。对照组18只，随机分为三组，与相应手术组做相同处理。以精索静脉最大径大于1 mm、左肾无缺血萎缩为造模成功标准。

1.3 标本采集

分别于术后2、4、8周取大鼠睾丸组织，一部分研磨，制成组织匀浆（w/v=1∶9），剩余部分用 Bouin′s 液固定 24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，蜡块包埋。于晨9时至11时下腔静脉取静脉血，离心后取血清，-40℃保存备用。

1.4 标本处理方法

1.4.1 HE染色 切片，厚度为4 μm，脱蜡，苏木素-伊红（HE）染色、脱水、封片。光镜下观察各组大鼠睾丸组织及生精上皮变化。

1.4.2 放射免疫方法 应用放射免疫法测定睾丸组织睾酮浓度（intratesticular testosterone concentration，ITC）及血清卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮（T）含量，试剂盒由北京北方生物技术研究所提供，具体操作步骤均按试剂盒说明书进行。

1.4.3 免疫组化方法 切片厚度为4 μm，采用SP法进行免疫组化染色，切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育15 min以消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清37℃封闭15 min，抗原修复，兔抗大鼠 AR、FSHR、LHR 抗体（1∶100）4℃过夜，恢复至室温，滴加生物素标记山羊抗兔IgG，37℃孵育15 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育15 min，以上各步骤间用pH 7.4的PBS缓冲液洗3次，每次3 min；DAB显色3～10 min，自来水终止显色；苏木素复染1 min，盐酸酒精浸泡5 s，氨水5 s，常规脱水，透明，封片。用PBS液代替一抗作阴性对照，其余步骤同前。结果用图像分析软件BI-2000医学图像分析系统对实验组和对照组大鼠睾丸AR、FSHR和LHR免疫组化灰度值进行测量和分析，每张切片（400×）随机选取5个视野，测量阳性细胞平均灰度值，平均灰度值越低表示免疫反应阳性越强。

1.4.4 细胞凋亡检测方法 切取4 μm厚睾丸组织石蜡切片，脱蜡、脱水、透明，其余步骤按试剂盒说明书进行TUNEL（试剂盒由北京中山金桥公司提供）染色法行细胞凋亡检测（加POD前在荧光显微镜下分析结果并拍照），细胞核染成棕色者为TUNEL阳性细胞，光镜下（400×）每张切片选取5个视野，计数500个细胞，计算凋亡细胞所占生精细胞的百分率作为生精细胞的凋亡指数（AI）。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 HE染色结果

对照组睾丸组织中生精上皮基膜完整，各期生精细胞排列有序，层次清楚，管腔里有大量精子。2周实验组较对照组无明显变化。4周实验组睾丸生精上皮基膜变薄，各级生精细胞减少，结构稀疏，管腔中精子数量减少，小管间隙变宽，间质细胞减少。8周实验组生精上皮基膜破裂溶解，各级生精细胞排列紊乱、数量减少，细胞间隙增大，细胞体积缩小，管腔中可见脱落的不成熟生精细胞，成熟精子细胞减少，间质水肿，间质细胞进一步减少。

2.2 放射免疫结果

见表1。

2.3 免疫组化结果

特异性AR免疫染色可见AR主要表达于间质细胞的细胞质及细胞核，其他可见于支持细胞、肌样细胞、精原细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞；FSHR主要表达于支持细胞的细胞质；LHR主要表达于间质细胞的细胞膜，间质细胞细胞质也有少量表达。其结果见表2。

2.4 细胞凋亡检测结果

2周实验组凋亡细胞主要为间质细胞，可见少量初级精母细胞凋亡；4周实验组可见间质细胞凋亡，曲细精小管中除精原细胞外，其他各级细胞都出现凋亡；8周实验组可见间质细胞明显减少，曲细精小管中除精原细胞外，其他各级细胞都出现凋亡，管腔变薄，细胞层次紊乱，管腔中可见大量凋亡的分裂晚期的精子细胞。对照组中可见少量凋亡细胞，主要集中在次级精母细胞及分裂期的精子细胞。两组凋亡结果见表3。

3 讨论

精索静脉曲张是青壮年男性常见病，是男性不育的重要因素，但精索静脉曲张与男性不育的确切关系目前尚无定论。研究发现，精索静脉曲张可致患者性激素分泌紊乱并可致下丘脑-垂体-性腺轴功能障碍，而性激素对生精功能有重要调控作用。睾酮主要由睾丸间质细胞分泌，受下丘脑-垂体-性腺轴的调节控制。睾酮的主要功能之一就是维持生精作用，如果睾酮分泌减少，精子发生过程将停滞在初级精母细胞阶段；FSH和LH均由腺垂体分泌，对生精过程均有调控作用。FSH对生精过程有启动作用，而睾酮对生精过程有维持效应；LH对生精过程的调节作用不是直接影响生精细胞，而是通过刺激睾丸间质细胞分泌睾酮而间接发生作用[5]。Li-Ming等[6]研究精索静脉曲张伴不育的患者时，发现行精索静脉曲张切除术后可显著提高患者的血清睾酮浓度，虽然升高患者的血清T浓度并不一定能够直接改善患者精液质量，但是可以改善患者激素分泌和生精功能。Cayan等[7]发现行精索静脉曲张切除术后可改善支持细胞和间质细胞功能，显著降低患者的FSH和提高患者的血清T浓度，并可提高精子浓度和活力。T、FSH和LH都是通过与其相应的受体结合后发挥调节作用，本实验试图通过精索静脉曲张对性激素、激素受体及性腺轴的影响来解释大鼠生精功能降低的发生过程和机制。

表1 各组大鼠左侧睾丸ITC和血清性激素浓度（ ±s）Tab.1 ITC and serum sex hormone concentrations of the left testis in rats of all groups( ±s)

表1 各组大鼠左侧睾丸ITC和血清性激素浓度（ ±s）Tab.1 ITC and serum sex hormone concentrations of the left testis in rats of all groups( ±s)

注：相同时间段内实验组与对照组相比有差异（P＜0.05）；实验组或对照组内不同时间段比较，▲与2周组比较有差异（P＜0.05）；★与4周组比较有差异（P＜0.05）Note：◆ there was significant differences between experiment group and control group （P＜0.05）;▲ there were significant differences compared with the 2-weeks group in experiment group or control group (P＜0.05),★ there were significant differences compared with the 4-weeks group (P＜0.05)in experiment group or control group

分组 只数 睾丸组织中睾酮浓度（nmol/L）血清睾酮浓度（nmol/L）卵泡刺激素浓度（ng/ml）黄体生成素浓度（ng/ml）对照组2周组4周组8周组实验组2周组4周组8周组666 666 9.32±1.71 9.51±1.50 9.48±1.45 1.07±0.28 1.12±0.26 1.14±0.19 1.06±0.32 1.35±0.58 1.30±0.56 2.98±1.0 2.89±0.5 3.20±0.6 9.01±0.98 7.11±1.74◆▲4.46±1.24◆▲★1.01±0.26 0.93±0.17 0.38±0.11◆▲★1.23±0.48 1.57±0.54 1.96±0.60◆▲3.02±0.5 3.24±0.8 5.35±1.37◆▲9 7363★

表2 各组大鼠左侧睾丸组织AR、FSHR、LHR平均灰度值（ ±s）Tab.2 The average gray value of AR,FSHR,LHR of the left testis in rats of all groups( ±s)

表2 各组大鼠左侧睾丸组织AR、FSHR、LHR平均灰度值（ ±s）Tab.2 The average gray value of AR,FSHR,LHR of the left testis in rats of all groups( ±s)

注：◆相同时间段内实验组与对照组相比有差异（P＜0.05）；实验组或对照组内不同时间段比较，▲与2周组比较有差异（P＜0.05）；★与4周组比较有差异（P＜0.05）Note：◆ there were significant differences between experiment group and control group (P＜0.05);▲ there were significant differences compared with the 2-weeks group in experiment group or control group (P＜0.05),★ there were significant differences compared with the 4-weeks group (P＜0.05)in experiment group or control group

分组 只数 雄激素受体 卵泡刺激素受体 黄体生成素受体对照组2周组4周组8周组实验组2周组4周组8周组666 666 144.29±7.85 144.41±5.46 141.78±6.85 128.57±8.00 120.49±4.04 126.89±8.28 156.89±8.22 155.64±11.80 155.45±10.34 136.61±3.65 154.98±8.58▲160.07±5.29◆▲122.47±4.34 125.02±6.54 141.28±5.73◆▲★138.77±7.41◆★158.45±6.46 171.31±8.29◆▲★

表3 各组大鼠左侧睾丸组织凋亡率（ ±s）Tab.3 The apoptosis rate of the left testis in rats of all groups( ±s)

表3 各组大鼠左侧睾丸组织凋亡率（ ±s）Tab.3 The apoptosis rate of the left testis in rats of all groups( ±s)

注：◆相同时间段内实验组与假手术组相比有差异（P＜0.05）；实验组或对照组内不同时间段比较，▲与2周组比较有差异（P＜0.05）；★与4周组比较有差异（P＜0.05）Note：◆ there were significant differences between experiment group and control group (P＜0.05)； ▲ there were significant differences compared with the 2-weeks group in experiment group or control group (P＜0.05),★ there were significant differences compared with the 4-weeks group (P＜0.05)in experiment group or control group

分组 只数 凋亡率（%）对照组2周组4周组8周组实验组2周组4周组8周组666 666 5.97±0.90 5.35±1.05 6.28±0.89 8.74±1.79◆★19.08±2.31◆▲30.61±1.77◆▲★

本实验发现，实验组大鼠造模成功后2周时睾丸间质细胞凋亡显著增加，随时间进展而进一步增加；实验组大鼠生精细胞于造模成功4周时凋亡显著增加，8周时凋亡进一步加重。造模成功4周时实验组ITC开始下降，且随时间进展而进一步下降，这个结果与刘建军等[8]的实验结果一致。4周时血清T浓度与对照组并无明显差异，可能是由于除睾丸组织外，肾上腺等分泌的T代偿性增加，维持血清T在正常浓度。血清T浓度于8周时开始下降，这与AndóS等[9]的研究结果一致，但Canales等[10]研究却发现VC并不明显降低患者外周血T浓度，这可能与外周血血清T浓度远远低于ITC，而不同程度的静脉曲张对间质细胞影响不同所致，本实验中实验组大鼠外周血T下降可能与ITC较4周时进一步下降而睾丸组织外睾酮分泌不足以代偿有关。血清FSH、LH浓度于造模成功8周后显著上升，这可能是由于血清T浓度下降使其对垂体抑制作用降低导致的。AR于造模4周后表达下降，这与ITC的下降是同步的，内源性T可控制睾丸内AR的表达，这可能与雄激素能降低AR的降解速率以及控制AR蛋白的生物合成有关[11]。FSHR在造模8周时表达显著降低，可能是由于血清FSH浓度升高，抑制了FSHR的表达。LHR在造模2周时表达显著升高，这可能是间质细胞凋亡减少后通过某种代偿机制使LHR表达升高，维持LH对间质细胞分泌睾酮的促进作用，使睾酮保持较高浓度，从而维持睾丸的生精作用；到4周时则与对照组比较无差异，LH对ITC分泌的刺激作用较2周时下降，这可能是由于睾丸间质细胞功能障碍致使LHR表达降低；到造模后8周时，LHR较对照组表达显著降低，可能是由于较高的血清LH以及间质细胞功能障碍等因素抑制了LHR的表达。

由于T和FSH都是通过各自的受体发挥生理功能，因此，AR和FSHR的变化反映了这两种激素在精子发生过程中的有序表达和整体功能，它们在T和FSH的作用下，共同调节精子发生过程中的程序性基因表达[12]。缺少其中的任何一种激素都会导致精子发生的障碍：缺乏T，则不能完成精子细胞的变态，而缺乏FSH，则会导致粗线期精母细胞的程序性死亡[13]。实验发现精索静脉曲张可致大鼠ITC、血清T下降，并使AR表达下降，而睾丸的生精过程需要睾丸组织高浓度的ITC。在精索静脉曲张进展初期，间质细胞就已经开始受损，且早于生精细胞，间质细胞可能通过上调LHR水平，来代偿性增加睾酮分泌，使睾酮维持在正常水平，随着间质细胞凋亡增加，ITC逐渐失代偿，而睾丸生精细胞凋亡增加与ITC下降同步，这与生精细胞成熟需要睾丸内较高浓度睾酮的结论是相符合的。垂体分泌FSH、LH受血清T浓度的影响，二者受体表达与其血清水平呈反比，在VC进展后期虽然二者血清浓度上升，可由于睾丸间质细胞过度凋亡，ITC显著下降，即使FSH及LH维持正常甚至较高的功能，生精过程也无法正常完成。

随着VC的进展，EV大鼠睾丸间质细胞及生精细胞的损伤和凋亡会逐渐增加，导致ITC及血清T浓度下降，并使睾丸AR表达降低；FSH、LH浓度会随着血清T下降而上升，二者睾丸受体表达随之出现降低。总之，VC通过影响ITC和血清T、FSH、LH浓度及其睾丸受体的表达，进而影响生精细胞发生、增殖和分化等一系列的生理过程，甚至引起不育。

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