新型免疫抑制剂 Sanglifehrin A发酵工艺的优化

彭招全,王 普,蔡 谨,黄 磊,徐志南

(1.浙江工业大学药学院,浙江杭州 310032;2.浙江大学化学工程与生物工程系,浙江杭州 310027)

Sanglifehrin A(SFA)是由链霉菌产生的一种新型大环内酯类抗生素,其化学结构如图 1所示。生物体免疫活性在分子水平上与亲环蛋白的调节作用是分不开的,而在细胞水平上主要与 T细胞、B细胞和树突细胞有关。因 SFA与亲环蛋白有较强的亲和力而表现出强大的免疫抑制活性,它与亲环蛋白的亲和力是目前常用的免疫抑制剂——亲环菌素 A的 20倍[1],并且不会影响钙调磷蛋白活性。SFA不仅能阻断细胞周期 G1阶段的 T细胞增殖[2],而且能在不影响 B细胞抗体合成的情况下,阻断 B细胞增殖[3]。树突细胞胞吞作用、摄取抗原和分泌白细胞介素 -12等免疫功能也受 SFA抑制[4,5]。此外,SFA还能抑制线粒体通透性转运孔的打开,保护心肌细胞免受缺血/再灌注损害[6]。它还能用来治疗丙型肝炎及肝纤维化、慢性间质性肝炎和肝细胞性肝癌等疾病[7]。然而,目前国内外报道的 SFA发酵水平都较低,在0.1～2 mg·L-1左右[1,8],而化学法合成的步骤繁冗复杂,产率很低[9]。因此,提高 SFA发酵水平成为 SFA真正走向市场的瓶颈。

埃森曼在对“向日葵”住宅的解读中，通过将虚体变为实体来概念化空间[7]17。这种虚体被包容在物质的边界里，这就是空间，也可以理解为格伯利尼提及的相互交流符号。空间由于界定物质的不同，是存在方向性的，继而产生不同的“所指”。大理传统民居是内向型的空间，但对比两个案例，揽清在围合内部院落的同时，院落与房间都朝向于洱海，外向型空间传达的“所指”是地块优异的风景条件；既下山在外围增加了大量的开窗，框景似的朝向熙攘的街道，形成大理当地人文气息的所指。

本文从新构建的重组 Streptom yces flaveolusDS M 9954出发,探讨发酵条件对提高其 SFA发酵水平的影响,为 SFA工业化发酵生产提供实验依据。

图1 SFA的化学结构式

1 材料和方法

1.1 菌种和培养基

1.1.1 菌种 Streptom yces flaveolusDS M 9954,浙江大学生物工程研究所保藏。

1.1.3 种子培养基 (g·L-1) 甘油 40,大豆蛋白胨 10,麦芽浸膏 21,pH 7.0。

1.1.2 斜面培养基 (g·L-1) 可溶性淀粉 10.0,K2HPO41.0,MgSO4·7H2O 1.0,NaCl 1.0,(NH4)2SO42.0,CaCO32. 0,FeSO4·7H2O 0.001,MnCl2·7H2O 0.001,琼脂 20,pH 7.0。

2.1 种龄和接种量对 SFA产量的影响 实验发现,Streptomyces flaveolusDS M 9954种龄和接种量对 SFA发酵的影响较大,结果见表 1和图 1。种龄为 30 h的种子液接入发酵培养基后发酵效价最高,为 2.01 mg·L-1。这说明适龄的种子液可以提供足够多的、生长旺盛的种子。接种量过低,会造成发酵延迟,发酵的效率降低;而接种量过大时,营养物质消耗过快,影响了后续次级代谢产物的合成,从而造成 SFA产量下降。从图 1可知,6%接种量可达到最高的发酵水平。

1.1.4 发酵培养基 (g·L-1):麦芽糖 40,黄豆饼粉 40, (NH4)2SO42.0,CuSO4·5H2O 0.0587,ZnSO4·7H2O 0.5, CaCO34.0,pH 7.0。

1.3 SFA含量测定 样品处理:将 25 mL发酵液与 25 mL乙酸乙酯混合,超声波处理并快速均匀搅拌 20 min,4 000 rpm离心 10 min,提取上层有机相,真空旋蒸至干,加入 1 mL甲醇溶解,过滤后作液相分析。

1.2.1 菌种保藏 斜面培养 6～7 d,收集孢子,悬浮于 20%甘油,冷冻保存。

该模块在设计和开发中采用了开放的、可扩展的基于服务的软件体系结构，使其可以无缝集成到已有的系统以及新开发的系统当中，为其他应用系统提供预警服务。同时，采用了自适应的实时数据扫描算法，当在需要预警的时间段内未扫描到水雨情数据时，引擎会自动缩短数据扫描时间，若在一段时间内仍未获取数据，才判定数据并不存在，恢复预设的扫描时间。此特性可防止因网络堵塞或故障带来的数据传输延迟而造成数据遗漏的情况，同时也保证了预警数据的实时性。

1.2.3 发酵培养基 按 4%接种量将种子液接入发酵培养基中,25℃培养 120 h,摇床转速为 250 rpm。

应用热力学第一定律对循环流化床锅炉的计算得到锅炉各处烟气温度以及各换热器出口温度进而应用热力学第二定律进行 分析。

1.2.2 种子培养取 1 mL孢子悬液,接种到 250 mL种子瓶中,培养基装量 25 mL,25℃培养 24 h,摇床转速 250 rpm。

1.2 培养方法

高效液相色谱仪分析:高效液相色谱仪安捷伦 1100,色谱柱 (Agilent TC-C18,250 mm×4.6 mm,5μm),进样量 20 μL,检测波长 242 nm,流速 1 mL·min-1,柱温 25℃,流动相为A:水 (0.05%的三氟乙酸);B:乙腈 (0.05%的三氟乙酸)。梯度洗脱条件B:0～5 min 40%,5～14 min 40～60%, 14～25 min 60～70%,25～27 min 70～95%,27～30 min 95～40%。

2 结果与讨论

2005—2015年，我国废水排放量由524.50亿t/年增至735.30亿t/年，复合增长率达3.44%。

表 1 种龄对 SFA生产的影响

图2 接种量对 SFA产量的影响

2.2 培养温度对 SFA产量的影响 Streptom yces flaveolus DS M 9954的发酵对温度非常敏感。从图 3可知,培养温度对 SFA发酵影响较大,30℃发酵时,SFA产量达到最高 (3. 65 mg·L-1)。而当低于或高于 30℃时,产量急剧下降。

第一，小学语文教学中经典诵读时间过短。当下由于小学语文课堂教学时间有限，教师难以保证课堂教学中经典诵读所占的时间比重，长此以往学生会逐渐对经典诵读失去学习积极性与主动性。与此同时，经典诵读是一个长期不间断的学习过程，但是小学阶段大部分的经典诵读都是由教师组织进行的，很难保证经典诵读的连贯性与持续性，致使课堂教学效果与教学效率较低。

图3 温度对 SFA发酵的影响

2.3 发酵液初始 pH值对 SFA产量的影响 培养基酸碱性也是影响微生物次级代谢的关键因素。从表 2可知,培养基初始 pH值 6.5时,产量达到 4.11 mg·L-1。一方面,这可能是因为与 SFA合成的关键酶在中性偏酸性条件下表现出最大活性,另一方面,SFA分子含有酚羟基 (图 1),中性偏酸性条件更有利于 SFA分子呈电中性,减少了细胞膜对 SFA的电荷效应,有利于 SFA的胞外分泌。

表2 发酵液初始pH值对 SFA发酵的影响

2.4 摇床转速及摇瓶装液量对 SFA产量的影响 液体培养基中营养物质和氧气的传质效应会直接影响 SFA发酵产物的积累。本文以摇床转速和摇瓶装液量为考察对象,分析了传质对 SFA发酵的影响。Streptom yces flaveolus的 SFA发酵过程对氧气和营养传递要求较高。结果如图 4、5所示。摇床转速为 100 rpm时,SFA产量几乎为零,这表明低转速可能不利于培养基中气体传质,缺氧导致部分细胞死亡,二氧化碳的积累也会使 SFA合成酶活性降低;但过高的转速有可能破坏链霉菌的菌丝体结构,降低链霉菌生产 SFA的能力。当转速达到 350 rpm时,SFA产量急剧下降。装液量对 SFA发酵的影响也很大。装液量过低造成水分挥发,影响发酵体系的渗透压;而过高的装液量影响了氧的传质,也容易导致菌体成团,不利于营养物质和氧气传递。摇床转速及摇瓶装液量对发酵产物影响的实验结果进一步证明了营养物和氧气的传质对 SFA等次级代谢产物积累的影响是非常明显的。这是发酵规模放大时需要重点考虑的要素之一。

2.5 SFA发酵进程 次级代谢产物是微生物发酵进入稳定期后期和衰亡期才产生的、非菌体生长和繁殖必需的物质。在发酵过程中次级代谢产物会经历产量逐渐增长、稳定和分解三个阶段。在菌龄、接种量、发酵温度、pH值、转速和装液量等发酵因素处于最佳值的情况下,考察 Streptomyces flaveo-l u s D S M9 9 5 4在发酵进程中,生物量和SFA产量变化。结果如图 6所示,在 72 h前,链霉菌的 SFA产量很低,在 108 h时菌体生长进入衰亡期,SFA产量达到最高值 6.12 mg·L-1。适当延长衰亡期将有利于进一步提高 SFA发酵产量。我们还发现发酵液的颜色会随着发酵时期而变化,从第三天开始由灰色转变为黄绿色,衰亡期伴随着各种色素产生。从色素的变化可以间接反映 SFA的产生和产量。

图4 摇床转速对 SFA生产的影响

图5 装液量对 SFA发酵的影响

图 6 SFA产量和细胞生长曲线

3 结论

实验研究发现,Streptom yces flaveolus发酵产生 SFA的过程对发酵条件非常敏感。这可能是很多关于 SFA发酵报道的产量偏低的重要原因。本文针对种龄、接种量、温度、pH、摇床转速和装液量等发酵重要参数进行了系统研究。经过条件优化,得到最佳发酵工艺:种龄 24 h、接种量 6%(v/v)、培养温度 30℃、发酵液初始 pH 6.5、摇床转速 300 rpm和装液量 25 mL/250 mL摇瓶。在最佳的摇瓶发酵条件下,SFA产量在发酵 108 h时,达到 6.12 mg·L-1,这是发酵条件优化前 (2.01 mg·L-1)3倍多。比其他报道的 SFA发酵水平都有明显的提高。当然,进一步扩大 SFA发酵规模,尤其是利用发酵罐深层培养将可能进一步提高 SFA的发酵水平。这些工作为推动 SFA大规模生产和临床应用提供了重要的实验基础。

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