抗双链DNA抗体不同检测方法的比对分析

张春雷,周小梅,张书楠,吕 琪,陈桂冰,李庆宽

(1.深圳市中医院医学检验科,广东深圳 518020;2.中南大学湘雅医学院2005级医学检验系,湖南长沙 410078）

抗双链DNA(double stranded DNA,dsDNA)抗体是系统性红斑狼疮(system ic lupus ery thematosus,SLE)患者的特征性标志抗体[1-2],对于SLE的诊断和治疗有着非常重要的作用,美国风湿病学会已将其列为SLE诊断标准之一,其特异性达到了(95～100)%。抗dsDNA抗体滴度的高低与SLE的活动密切相关[3-4],抗体滴度高提示SLE处于活动期。该抗体直接与肾小球细胞中DNA结合或与循环血液中DNA结合形成免疫复合物,沉积于肾小球基底膜,抗dsDNA抗体检测是目前SLE患者诊断及治疗最常用的指标之一。检测抗dsDNA抗体的方法较多,常用的有间接免疫荧光法(indirect immunofluorescent assay,IIFA)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫印迹法(immunobiotting test,IBT)等,本课题将以上3种检测方法进行比较,具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2009年4月至2010年4月在深圳市中医院就诊,确诊为SLE的患者血清标本70人份(清晨空腹抽血,分离血清并置2～8℃冰箱备检)作为实验组,患者的选择符合美国风湿协会关于SLE的诊断标准,其中男12例,女58例,年龄 16～70岁,平均 34.5岁。将血常规、肝肾功能检查结果正常的健康体检者的血清标本650人份作为健康对照组,其中,男305例,女 345例,年龄 20～ 50岁。

1.2 主要试剂与仪器 绿蝇短膜虫dsDNA IIFA试剂盒(30T)、抗dsDNA抗体(IgG)ELISA检测试剂盒(96T)、抗核抗体谱IBT试剂盒(64T)均购自德国欧蒙医学诊断技术有限公司;主要采用ZEISS型荧光显微镜(德国)、TS-8型转移脱色摇床(上海)及 ELX-800型酶标仪(美国)进行实验。

1.3 方法 同时采用IIFA、ELISA和IBT法对实验组及健康对照组血清标本进行抗dsDNA抗体的检测。3种方法严格按照试剂盒使用说书进行操作,将试剂盒所带的阳性对照、阴性对照与待测标本同时测量。IIFA定性检测:荧光显微镜下观察到试剂盒检测薄片绿蝇短膜虫动基体出现苹果绿荧光为阳性。ELISA半定量检测:以标准品2(浓度100 IU/m L)为测定临界值,与待测样本同时测量,选择酶标仪比色波长为450 nm,参考波长为630 nm,加终止液后30m in之内比色,其中测定结果大于或等于100 IU/m L为阳性,小于100 IU/m L为阴性。IBT定性检测:反应膜在特定位置出现肉眼可见的、与质控带颜色相同的显色条带为阳性,否则为阴性。

1.4 统计学处理 多样本率的比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

健康对照组与实验组检测结果见表1。实验组IIFA法检出的24例抗dsDNA抗体阳性标本中,ELISA、IBT法检测均为阳性;IBT法检测的31例抗dsDNA抗体阳性标本中,ELISA法检测也为阳性。ELISA和IBT检出阳性率与IIFA方法比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 IIFA、ELISA及IBT法检测实验组与健康对照组中抗dsDNA抗体的结果比较[n(%)]

3 讨 论

实验结果提示ELISA检测抗dsDNA抗体敏感性最高,可进行半定量检测,有助于对SLE的诊断及病情活动程度的监控[5-6]。同时,ELISA检测不需要特殊设备,适合基层医院及标本量较多的实验室进行筛查,具有较好的市场前景。本实验健康对照组ELISA检测中有29例抗dsDNA抗体阳性,而临床追踪调查并未发现有相应的临床表现,这可能是因为ELISA检测的影响因素较多,譬如标本稀释、抗原板的洗涤、酶标仪的校准等均可造成结果误差;其次,由于ELISA检测采用生物提取dsDNA作为实验基质,在制备过程中,DNA的内部结构位点可能存在人为暴露,会因单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)抗体的存在而产生非特异性反应[7-8]。尽管如此,由于ELISA检测的高度敏感性,结合患者的临床表现,它仍不失为一种较好的筛查方法。

IIFA检测抗dsDNA抗体是采用绿蝇短膜虫作为抗原基质进行检测的,其动基体只由高纯度的环状dsDNA构成,除此之外,不含有其他细胞核抗原,因此具有高度特异性,被认为是检测细胞内抗原自身抗体的金标准[9-10],是一种较好的确证方法。实验中,IIFA、ELISA及IBT 3种方法均显示抗dsDNA抗体阳性的标本有24例,与患者临床跟踪调查结果一致。然而IIFA结果的判断有一定的主观性,易受检测人员技术水平及主观因素影响,且荧光显微镜价格昂贵,基层医院难以开展,本实验提示IIFA的敏感性相对较低,不能准确定量。因此,IIFA检测在临床诊断和治疗方面,难以起到准确的监测作用[11]。

IBT检测抗dsDNA抗体操作简便、省时、特异性好、用血量少、无需特殊设备、重复性好,可同时完成对14种自身抗体的识别和过筛,对提高自身免疫疾病的诊断水平有很大的帮助,适合于各大医院推广应用。然而IBT检测中,由于一张硝酸纤维膜上有数种成分显示,多个条带相距很近,每次电泳时不同蛋白质在凝胶中迁移的速率不同以及蛋白质区带在电泳时形成的斜率,给这些条带的识别带来一定困难,特别是对临界阳性的标本,不同操作者对结果的判断也不尽相同,很容易造成误判或假阳性,IBT试剂在生产过程中可能发生抗原转印不充分或转印时发生抗原丢失,影响结果判定,导致假阴性[12]。

在临床工作中,根据实际情况采用联合检测[13],并结合患者的临床表现来判断结果。同时,提高ELISA检测的特异性以及IIFA检测的敏感性是当前研究的重点,目前利用荧光PCR检测dsDNA含量的方法受到了越来越多的重视[14-15],在今后的检验工作中将扮演越来越重要的角色。

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