弓形虫感染过程中蛋白磷酸化 /去磷酸化对宿主细胞信号的影响*

蛋白磷酸化/去磷酸化是指蛋白激酶(Protein kinase,PK)催化蛋白质的含羟基氨基酸(丝/苏和酪)的侧链羟基形成磷酸酯,和蛋白质磷酸酯酶(Protein phosphatase,PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯键水解而去磷酸化的过程。蛋白磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一,这一可逆过程受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制,细胞内任何一种蛋白质的磷酸化状态是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的两种酶活性之间的平衡决定的。蛋白磷酸化/去磷酸化是细胞信号传递过程中普遍存在的现象,在调节信号传递过程中起重要作用。在刚地弓形虫入侵和寄生于宿主细胞的过程中,不但其自身蛋白发生磷酸化/去磷酸化,而且其所入侵、寄生的宿主细胞的蛋白也会广泛地发生磷酸化/去磷酸化。被弓形虫感染的宿主细胞信号通路出现大规模的改变,主要表现在以下几方面：弓形虫分泌蛋白调控宿主细胞信号转导;弓形虫调节宿主的天然免疫和保护性免疫、抗凋亡反应、细胞周期变化、钙离子等相关的细胞信号通路。以上细胞信号通路的变化与弓形虫或宿主细胞的蛋白发生磷酸化/去磷酸化密切相关,蛋白磷酸化/去磷酸化是弓形虫与宿主细胞间相互作用的关键事件。

1 在刚地弓形虫入侵、寄生过程中虫体蛋白的磷酸化

滑动相关蛋白(gliding-associated protein,GAP)：弓形虫的运动是肌球蛋白XIV复合体驱动的,这个复合体由肌球蛋白XIV重链(XIV heavy chain,MyoA)、轻链(myosin light chain,MLC1)、GAP45和GAP50(一种膜锚定复合物,为刚地弓形虫内膜复合体的必备膜蛋白)组成,肌动蛋白聚合是寄生虫活动力与入侵宿主细胞过程的中心环节。MyoA,MLC1,和GAP45首先结合在一个可溶性的复合体中,然后再与GAP50结合,肌球蛋白XIV复合体的所有蛋白都是刚地弓形虫存活所必须的。研究证明这个驱动复合体的最终组合成功取决于GAP45的磷酸化。这个蛋白的磷酸化发生在多个氨基酸残基上,如Ser(163)和Ser(167),这两个氨基酸的磷酸化控制着肌球蛋白XIV驱动复合体组合的最终步骤[1]

棒状体蛋白(Rhoptry proteins,ROPs)：弓形虫的侵袭力与毒力有关,ROP家族被认为是决定弓形虫毒力的蛋白,由棒状体分泌,在弓形虫入侵宿主细胞时注入细胞质内。成熟、加工过的跨膜蛋白ROP4定位于弓形虫棒状体上,分泌的 ROP4与泡膜有关,且在受感染的细胞中发生磷酸化。ROP2也有类似的结果。对 ROP4进一步分析表明,它在多个位点发生磷酸化,被感染细胞内的 ROP4和ROP2蛋白家族成员被定位和转录后,在泡膜功能中发挥重要作用[2]。N-端关键氨基酸残基的自磷酸化导致ROP18活化,ROP18活化又使 ROP2和ROP8磷酸化,当磷酸化的N-端解除自我抑制后,ROP18被最大程度地激活。这种调节ROP激酶活性的的方式代表了弓形虫的毒力[3]。弓形虫ROP16在入侵时被注入宿主细胞胞质,然后到达细胞核,影响了不同的信号通路,如在免疫反应启动过程中的关键分子STAT3/6及其下游的宿主细胞因子IL-12等信号通路,并与不同毒力株引起的病理变化有关[4]。

致密颗粒抗原(dense granules antigen,GRA)：致密颗粒蛋白是由刚地弓形虫致密颗粒细胞器分泌的一类具有免疫活性的蛋白质,约有13种包括GRA1-GRA9,三磷酸核苷水解酶的同工酶NTPaseI和NTPaseⅡ,以及两个蛋白酶抑制剂。GRA7含有疏水和跨膜结构,可直接嵌入纳虫泡膜,只有在宿主细胞中才能被磷酸化,入侵10min之内,GRA7存在于宿主胞质中含有棒状体蛋白的(包括GRA1和GRA3)绳索状结构上,和棒状体蛋白 ROP2和ROP4结合,参与纳虫泡的形成和保护虫体在细胞内的存活与增殖[5]。

真核起始因子2(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)：弓形虫eIF2α的磷酸化是对环境压力的保守性反应,其磷酸化位点的突变导致该蛋白不被磷酸化,而使具有该突变位点的弓形虫不能适应细胞外的生存,存活力大大下降。而且该突变虫体在体内引起急性弓形虫病的时间也显著延长。弓形虫在寻找新宿主细胞的过程中需要抵抗外环境的压力,弓形虫eIF2α被磷酸化,从而改善细胞外环境压力,在细胞裂解周期中起着重要的作用,在缓殖子体内,弓形虫IF2α保持磷酸化状态[6-7]。

2 在弓形虫入侵、寄生过程中宿主蛋白的磷酸化

2.1 弓形虫ROPs直接使宿主细胞蛋白磷酸化细胞免疫相关GTP酶(immunity-related GTPase,IRG)磷酸化：弓形虫毒力因子ROP18激酶的靶标是一种由IFN诱导的IRG家族蛋白,也是小鼠抵抗弓形虫弱毒株的有效因子。IRG蛋白的GTP结合位点的活化构象Switch I区域是抗弓形虫的关键位点,弓形虫强毒株的ROP18激酶能使IRG蛋白磷酸化(将IRGa6的核苷酸结合结构域上的两个Thr残基磷酸化),从而使IRG酶失活,抑制其在纳虫泡膜上的聚集和降解纳虫泡最终清除弓形虫的作用[8]。

信号转导与转录因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)磷酸化：ROP16是弓形虫关键的毒力因子及宿主细胞转录调节因子,ROP16具有酪氨酸激酶活性,通过将STAT6的关键酪氨酸 Tyr(641)磷酸化而诱导STAT6持续活化和快速活化(1分钟以内),弓形虫感染细胞免疫共沉淀的实验证明ROP16与STAT6可相互结合,而且STAT6是ROP16的直接底物[9]。弓形虫入侵细胞伴随着快速和持续的宿主细胞STAT3的活化,宿主被弓形虫感染后天然免疫系统依赖于STAT3产生促炎症细胞因子。ROP16缺失的I型弓形虫感染的巨噬细胞体内没有发现野生型弓形虫诱导的STAT3的活化,但是IL6及IL-12 P40的表达却显著升高,II型虫株不能抑制免疫反应是因为ROP16的功能缺失。在哺乳动物细胞内过表达的ROP16导致STAT3磷酸化及STAT3-依赖启动子的强活化,ROP16与STAT3结合直接诱导这个转录因子的磷酸化[10]。

2.2 受弓形虫感染后宿主细胞蛋白的磷酸化反应

2.2.1 调节宿主的天然免疫和保护性免疫 ①促炎症反应细胞因子的活化：参与免疫反应的早期和炎症反应各阶段的许多分子都受NF-κ B的调控,被弓形虫感染的哺乳动物细胞可导致NF-κ B下调和I-κ B kinase(IKK)活化而使 I-κ Bα磷酸化。NF-κ B级联信号的终止与p65/RelA磷酸化的减少有关,而且磷酸化的p65/RelA可使NF-κ B进入细胞核与DNA结合,因此在 NF-κ B级联信号中,磷酸化的p65/RelA有可能被病原体破坏而导致 NF-κ B下调。与NF-κ B激活一致的是,弓形虫感染促进I-κ B的磷酸化,磷酸化的I-κ B聚集在纳虫泡膜上,这个现象表明有弓形虫本身的成分参与调节宿主NF-κ B信号通路以引起弓形虫感染的免疫反应过程[11]。

胞内弓形虫可使小鼠巨噬细胞(Mphi)中MAPK迅速激活,弓形虫引发的IL-12的生成依赖于有丝蛋白原活化蛋白激酶p38(mitogen-activated protein kinase 38,MAPK p38)。合成的p38催化位点抑制剂阻断了速殖子诱导的p38(MAPK磷酸化,说明弓形虫胞内感染可触发p38 MAPK自体磷酸化[12]。

②Toll样受体(T oll like receptor,TLR)相关信号通路的活化：TLRs是生物的一种模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),它主要通过识别病原相关分子来启动免疫反应,可激活下游一系列衔接蛋白和信号分子并最终活化核因子NF-κ B,启动炎症分子、细胞因子及共刺激分子的表达。而MyD88是Toll受体信号通路中的一个关键接头分子,是第一个被鉴定的含 TLR结构域的接头蛋白分子,在传递上游信息和疾病发生发展中具有重要的作用。T LR与配体的结合可加强其本身二聚体化及与MyD88蛋白的结合。MyD88的N端片段可与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(IL-1receptor accessory protein kinase,IRAK)相互作用,促使IRAK的自体磷酸化。TLR与配体结合后还可通过MAPK的Jun N端激酶(Jun N-terminal kinase,JNK)激活活化蛋白1(activator protein-1,AP-1)转录因子家族(Jun和Fos)。核转录因子NF-kB和AP-1为产生细胞因子所必需的蛋白[13-14]。

MD-2是一种分泌蛋白,存在于TLR4细胞外区域,可以稳定 TLR4二聚体并增强其功能。在LPS刺激的反应中,CD14和 TLR4/MD-2的联合作用可以增强ERK、JNK、p38MAP激酶的磷酸化,促使TNF-α(人外周血单核细胞肿瘤坏死因子)高度表达[15]。

2.2.2 调控宿主细胞抗凋亡反应[16-17]和细胞周期性[18]：弓形虫在宿主体内可引起持续感染,其在细胞内生存的能力很大程度上取决于自身阻断宿主细胞凋亡信号通路的能力,刚地弓形虫调控的几种细胞信号通路包括 NF-κ B和 JNK。宿主转录因子NF-κ B在刚地弓形虫介导的抗凋亡中起着关键的作用,因为在缺少NF-κ B亚基p65(RelA)的细胞中不出现凋亡抑制的现象。在用凋亡刺激因子 UV和TNF-α处理时出现明显的JNK活化异常,在Hela细胞中,弓形虫感染可抑制JNK磷酸化,但并不影响JNK激酶的活性[19]。另外,在弓形虫感染的宿主细胞中,PI3K(phosphoinositide 3-kinase)信号通路及其下游的效应因子蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)被活化,并在抗凋亡作用方面起着重要角色,PI3K的抑制剂wortmannin和LY294002可以阻断刚地弓形虫诱导的PKB磷酸化[20]。

丝/苏氨酸激酶mTOR(mammalian-target-ofrapamycin)是一种调节细胞合成、代谢、生长及增殖的重要的因子。弓形虫侵入各种细胞后会快速诱导mTOR活化,同时被核糖体蛋白磷酸化所控制。然而与mTOR作用相关的mTOR底物4E-BP1和S6K1的磷酸化却检测不到,尽管S6K1磷酸化的程度很低,但感染细胞依然会在胰岛素的诱导下使S6K1和4E-BP1产生磷酸化。宿主细胞的mTOR位于围绕刚地弓形虫纳虫泡的小泡上,虽然不能使4E-BP1和S6K1磷酸化,但宿主细胞内的刚地弓形虫以一种mTOR-依赖的方式和速度来激活宿主细胞周期程序[18]。

2.2.3 调控宿主细胞钙离子信号通路,从而调控弓形虫运动、入侵、和逸出细胞及宿主细胞的免疫等过程[21-22]钙离子在刚地弓形虫的生活史中起着重要的作用包括免疫、运动、入侵、和逸出细胞等过程。在弓形虫入侵宿主过程中自身的滑动结构组分(glideosome apparatus components)被磷酸化。弓形虫钙调蛋白样结构域蛋白激酶异构体3(T.gondiicalmodulin-like domain protein kinase isoform 3,TgCDPKif3)酶触反应的赖氨酸残基被丙氨酸代替后,磷酸化也被消除,TgCDPKif3将组蛋白 II(AS)作为一种代表性的底物以Ca2+-依赖的方式在高Ca2+浓度下使其磷酸化,在体内,TgCDPKif3能够将弓形虫醛缩酶 1(T gALD1)磷酸化,TgCDPKif3通过将滑动复合体磷酸化参与弓形虫的运动[23]。

然而宿主细胞的钙离子是弓形虫诱导MAPK、LPS(lipopolysaccharide)及CpG的活化,IL-12合成必需的,用弓形虫处理或LPS诱导的巨噬细胞内的钙离子增强了MAPK的磷酸化,由弓形虫诱导的并且依赖钙离子的PKC?和PKC?的急性活化反应是宿主的MAPK活化及IL-12产生所必需的,因而钙离子和PKC都是刚地弓形虫感染引起宿主细胞产生天然免疫反应的关键因素[21]。

综上所述,蛋白质的磷酸化与去磷酸化这个可逆的过程保证了弓形虫与宿主细胞对彼此间细胞信号的持续反应,在刚地弓形虫入侵和寄生于宿主的过程中,通过自身蛋白磷酸化和去磷酸化以及诱导宿主细胞蛋白的磷酸化/去磷酸化,对宿主细胞进行精细的整体的调控,在诱发及抑制宿主免疫反应之间保持一个精细的平衡,保证弓形虫在宿主细胞内安全地生存增殖,并有机会传播给终末宿主[24]。在宿主细胞被感染的过程中,宿主细胞信号传递发生广泛的变化,包括细胞信号蛋白表达水平的改变及蛋白的磷酸化和去磷酸化。这些细胞信号的调控在弓形虫入侵、寄生及与弓形虫-宿主相互关系中起着非常重要的作用。

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