扩展的简单串联重复位点诱发突变在遗传毒理学的应用进展

梁春柳，姚朗，张天宝

(1.南方医科大学卫生毒理学教研室，广东广州510515;2.第二军医大学卫生毒理学教研室，上海200433)

扩展的简单串联重复位点诱发突变在遗传毒理学的应用进展

梁春柳1，姚朗1，张天宝2

(1.南方医科大学卫生毒理学教研室，广东广州510515;2.第二军医大学卫生毒理学教研室，上海200433)

扩展的简单串联重复(ESTRs)序列是基因组DNA上高不稳定的一类重复序列。由于其自发突变和诱发突变率高，因而在生殖细胞诱发突变中的研究中得到广泛的应用。随着研究的深入，目前发现有3类重复序列——小卫星、微卫星和ESTRs，主要通过系谱法和单分子PCR法来研究这些重复序列的变化。但迄今为止，这些重复序列的突变机制还不明确。本文主要综述了目前国内外对这3种重复序列的异同、ESTRs突变研究方法的优缺点以及突变机制。

串联重复序列;等位基因;突变;系谱;聚合酶链反应

对小鼠生殖细胞诱发突变的分析是目前评价人类暴露于化学诱变剂和射线所产生的遗传危险的主要依据。而大部分小鼠诱发突变资料是通过特异位点实验(russell 7位点实验)或显性致死实验获得［1-2］。虽然这两个实验都可为化合物诱发突变及其精子生成阶段特异性提供重要信息，但是有两个缺点:第一，检测位点的自发突变率很低，因而需要大量的F1代样本才能获得有统计学意义的结果。第二，为了在F1代检测到有统计学意义的突变，F0代必须暴露于高浓度的受试物中。故当小鼠暴露于低浓度甚至是中浓度化学诱变剂时，这两种方法检测生殖细胞诱导突变的敏感性不高，而这一剂量范围又是遗传毒理学所关注的。因此，需发展更敏感、更有效的方法来评价化学诱变剂的生殖效应。

扩展的简单串联重复(expanded simple tandem repeats，ESTRs)位点是基因组DNA上极不稳定的等位基因位点。它是由短核心序列单位组成的长重复序列，其自发突变和诱发突变的发生率都很高。1993年Dubrova等［3］首次提出用ESTRs分析生殖细胞诱导突变，用ESTRs作为生物标志来研究生殖细胞诱发突变所需的样本量比用传统方法的少得多，并且可研究低剂量暴露条件下甚至是环境相应暴露水平下生殖细胞的诱发突变。目前，ESTRs已成为研究生殖细胞诱发突变和其后代遗传危险度的有效工具［4-5］。本文拟扼要综述基因组ESTRs位点诱发突变的研究现状。

1 ESTRs与小卫星和微卫星的异同

在过去十几年中，人们通常用人类小卫星位点和小鼠ESTRs位点来研究生殖细胞诱发突变［6］，少数研究中还用到微卫星位点。这三类重复序列的主要区别在于其长度和核心重复序列单位的大小［7］。人类小卫星大多是在真核生物中发现的，并主要存在于非编码区，其核心重复序列长度为10～60 bp，可扩增到0.5～1 kb大小，且其突变几乎只发生于生殖细胞中。而ESTRs目前只在小鼠DNA上发现，由4～6 bp的核心重复序列构成，可扩展到长0.5～16 kb，且在生殖细胞和体细胞中其都可发生突变。而微卫星则较短，它的核心重复序列长度为1～6 bp，最多可扩展到600 bp。这三类位点的相同点是:在不同的序列中，其核心重复单位是不变的，但重复单位的数量却是多变的。等位基因重复单位的种类及其数量的差异，是造成这些重复序列多态性的主要原因。这些位点大多都不稳定，自发突变率较高，并且可产生诱发突变。因此，用这些位点来研究生殖细胞诱发突变时所需的样本量比传统方法的少得多，因而备受关注［8-18］。

2 ESTRs突变的研究方法

2.1 系谱分析法

系谱分析法就是通过比较子代指纹图谱条带与其父本和母本条带的偏移情况，来判断是否发生突变的［3］。但若同一窝子代中都出现相同条带的突变或出现新条带，则不能判定为突变。该方法的实验步骤及实验数据处理相对简单，但为了获得有统计学意义的结果，需要大量的子代样本，实验周期比较长，工作量也较大，费时费力，而且还可能涉及伦理学问题。

2.2 单分子PCR法

近几年来，人们发展了单分子PCR的方法来研究ESTRs诱发突变。单分子PCR是一种以极少量DNA分子(1，5或10个分子)为模板而进行的扩增的聚合酶链反应。在高保真度DNA聚合酶作用下，它能扩增出高度一致的DNA分子。与常规PCR相比，它有以下优点［19-21］:①模板数极少，通常为1，5或10个DNA分子;②反应体系微量化，大多为5～10 μl;③可构建出大小可控的文库;④应用前景广阔，选用的聚合酶不同，其用途也不同。

因为该方法所需的样本量较少，实验中不必考虑伦理学问题。更重要的是，该方法既可研究体内ESTRs诱发突变，也可通过体外实验的方法来研究，并可查出生殖细胞和体细胞组织的从头合成突变。这为ESTRs诱发突变机制的研究提供了便利的条件。但用该方法研究ESTRs突变时，也存在一些缺陷。单分子PCR反应体系微量化，引物之间易形成二聚体，从而降低反应体系的扩增效率。而扩增产物需要进行两次Southern杂交才能判定是否发生了突变。实验操作过程比较繁琐，且需要分析亲本模板数等更多的数据信息。

3 ESTRs突变的界定标准

判断ESTRs突变的标准不同对实验结果影响较大。目前大多采用DNA系谱法直接比较F1代和其亲本ESTRs条带的电泳移动率。在精确要求的情况下，只要呈现＞200 bp的移动率就可鉴定为突变［8］，其他还有将＞30 bp［9］，甚至＞15 bp界定为突变的［10］。由于ESTRs突变主要是指核心序列单位的插入或缺失，用高精度的评分标准则低估实际的突变率，从而可能丢失部分诱导突变效应。严格执行突变评分标准就会使整体的突变率急剧降低，但不会影响诱导突变的大体趋势。ESTRs突变的界定标准有用迁移率≥1 mm或≥2 mm的。但＞2 mm的条带改变不常见。提高迁移率的评分标准，将会损失部分突变信息。由于ESTRs诱发突变实验可能受实验所用鼠系、剂量范围和鉴定突变标准的影响。所以，除非是在同一实验室进行，或是用同一实验方案，否则各实验中得到的ESTRs突变率不能直接进行比较。但能对不同实验中得到的ESTRs诱发突变率进行相对比较分析。

4 ESTRs突变机制

对ESTRs突变研究发现，在作用靶点上其突变率并不升高，而在靶点外却呈现升高，且此突变可以传递到下几代，故认为ESTRs诱发突变是由非靶点的间接突变机制造成的。Sadamoto等［11］发现精子受辐射后其F1代来源于母本的等位基因的突变率轻微升高。这一现象进一步验证了ESTRs位点诱发突变是由间接的机制引起的。但其突变的确切分子机制尚未清楚。有研究发现，ESTRs突变和微卫星突变相似，主要通过有丝分裂和(或)减数分裂复制滑移而产生突变。而人类小卫星突变则主要基于重组的机制产生突变的［6，12］。

5 ESTRs位点诱发突变的研究进展

5.1 ESTRs的鼠系差异

ESTRs位点序列在不同小鼠品系中存在差异。例如，Barber等［14］发现不同鼠系ESTRs位点的自发突变率和射线诱导的跨代不稳定性存在差异，并发现以下3个鼠系的突变率为BALB/c＞CBA/H＞C57BL/6，同时还发现ESTRs位点突变率的差异可能与细胞周期素依赖性激酶抑制剂2a(Cdkn2a)基因和DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(Prkdc)基因的功能性差异有关。而ESTRs的鼠系差异性不仅表现为其突变率的高低，也出现等位基因长度的不同。如，scid/C.B-17品系小鼠亲本的两个等位基因——Ms6-hm和Hm-2的平均长度为4 kb和7 kb;C57BL/6品系小鼠的则分别为7 kb和10 kb;PARP-/-/PARP+/+小鼠的分别为6.5 kb和5 kb;而CBA/J小鼠的则分别为3 kb和8 kb［15］。这些特点更说明不同实验条件下的结果不能直接进行比较。

5.2 ESTRs阶段特异性

早期研究发现，射线可诱导生殖细胞ESTRs突变率增高，但研究精子形成过程中诱发突变敏感期时却得到相互矛盾的结果。Yauk等［10］用1Gy X线单次急性照射C57BL/6×CBA/H杂交的F1代雄性小鼠，10周后处死，取脾、脑和附睾，用单分子PCR法分析ESTRs突变，结果发现精子ESTRs突变率显著升高。后来有研究发现精原细胞和精原干细胞受辐射后ESTRs诱发突变率显著增高［13］。因此，目前普遍认为有丝分裂前的雄性生殖细胞对电离辐射诱导ESTRs突变敏感。此外，在有丝分裂前受辐射的精子中可直接观察到ESTRs突变。这一时间与特定位点实验不同，后者的敏感期是在减数分裂的晚期精母细胞和减数分裂后期的精子细胞期。对于ESTRs诱发突变的时期特异性，Niwa等［15］对其可能的影响因素进行讨论，认为精子细胞暴露时间的轻微差异是导致时期特异性不同的原因。

在化学物质诱导小鼠生殖细胞ESTRs突变的研究中也发现时期特异性。Vilariño-Güell等［17］将雄性小鼠暴露于乙基亚硝基脲和异丙基甲磺酸和依托泊苷后，用系谱法研究发现乙基亚硝基脲和异丙基甲磺酸可使小鼠减数分裂前的精原细胞ESTRs突变率增高2.2～3.0倍，但减数分裂后精子细胞的ESTRs突变率则不发生变化。这一研究首次系统地说明化学诱变剂实际上是可以诱导ESTRs突变的，且减数分裂和减数分裂前的二倍体雄性生殖细胞对诱发突变敏感。

Yauk等［16］在小鼠暴露于空气颗粒污染物后，用单分子PCR法研究发现，小鼠暴露于空气颗粒污染物10周，并脱离接触6周后，其生殖细胞ESTRs突变率升高1.6倍，而接触3周及10周的小鼠生殖细胞ESTRs突变率则不变。

5.3 ESTRs位点诱发突变的剂量反应关系

在射线诱导ESTRs突变的研究中，Niwa等［9］用系谱法研究发现父本减数分裂后的精子细胞受0.35，0.7和1.02 Gy的中子辐射后，其ESTRs位点Ms6-hm的突变率分别升高2.1，3.1和2.9倍。在化学物质诱导生殖细胞ESTRs位点突变的研究中也发现类似的现象。Vilariño-Güell等［17］对暴露于乙基亚硝基脲和异丙基甲磺酸等化学物质的雄性小鼠进行研究，暴露剂量为12.5～25 g·L-1时减数分裂前生殖细胞的ESTRs诱发突变率呈直线上升。但暴露剂量超过此范围后，ESTRs诱发突变率就会出现平台期。随后Glen等［18］用单分子PCR法研究几种抗癌药物诱导小鼠ESTRs突变时发现，小鼠接触丝裂霉素C 2.5和5 mg·kg-1，其ESTRs位点突变率增加，并呈现剂量反应关系;接触美巴那肼(甲苄肼，mebanazine)50 mg·kg-1，ESTRs位点突变率增加，但当剂量为100 mg·kg-1时，突变率却未增加。

总之，在低剂量范围内，ESTRs诱发突变率随着作用剂量的升高而升高，但达到一定浓度后，其突变率会出现饱和。但由于ESTRs诱发突变是非靶点的，其剂量-反应之间不存在机械性的联系。从而使得解释ESTRs诱发突变较为困难，尤其是在获得预期外的结果之后更难以解释。

6 展望

理论上用ESTRs位点来分析诱导突变，其敏感度很高，利于人们进行低剂量暴露诱导遗传突变的研究。然而，由于人们对生殖细胞ESTRs诱发突变的细胞和分子机制以及ESTRs突变率和非中性位点之间的关系的认识很少，阻碍了对ESTRs突变进行深入地研究。另外，目前仅发现小鼠ESTRs的2个位点，并且在ESTRs诱发突变的剂量反应和时期特异性的研究中出现一些矛盾的结果。因此，要想使ESTRs位点在毒理学上得到广泛的应用，则需要进一步弄清其诱导突变的机制，并且应该继续在可控的条件下对ESTRs诱发突变的剂量反应和时期特异性进行深入研究，以验证结果的正确性。

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Expanded simple tandem repeat loci induced mutation in genetic toxicology and its progress

LIANG Chun-liu1，YAO Lang1，ZHANG Tian-bao2
(1.Department of Health Toxicology，Southern Medical University，Guangzhou510515，China;2.Department of Health Toxicology，the Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

Expanded simple tandem repeats(ESTRs)are unstable tandem repetitive DNA loci，which are applied largely in induced mutation of germline，because of the high spontaneous mutation rate.So far，three types of repeat sequences have been found.They are named a small satellite，microsatellite and ESTRs，respectively.While pedigree and single-molecule PCR are used to monitor changes in repeat sequences.However，the mutation mechanisms of these repeat sequences are exactly unknown till now.So，in this paper reviewed，the similar and differences of three different repeatitive loci，the advantages and disadvantages of the two methods，as well as the mutation mechanism were focused.

tandem repeat sequences;alleles;mutation;pedigree;polymerase chain reaction

The project supported by a grant from Shanghai Key Discipline of Public Health Project(08GWZX0301)

ZHANG Tian-bao，E-mail:tbzhang2001@yahoo.com.cn

Q394.6，R965

A

1000-3002(2011)05-0487-03

10.3867/j.issn.1000-3002.2011.05.014

上海市公共卫生重点学科建设项目(08GWZX0301)

梁春柳(1985-)，女，硕士，主要从事遗传毒理学研究。

张天宝，E-mail:tbzhang2001@yahoo.com.cn

2010-11-15接受日期:2011-02-25)

(本文编辑:付良青)