脑缺血后适应脑保护的研究进展*

张川荛， 李树清

(昆明医学院病理生理教研室，云南 昆明 650500)

脑缺血后适应脑保护的研究进展*

张川荛， 李树清△

(昆明医学院病理生理教研室，云南 昆明 650500)

脑缺血; 后适应; 脑保护

近年的研究发现，心梗病人血运重建后的头几分钟多次阻塞、再灌注，便可获得与缺血预适应(ischemic preconditioning，IP)相同的效果，即缺血后适应(ischemic postconditioning，PC)，类似于动物心脏研究所见。由此断定，缺血PC是一种在方法上与IP完全不同，但效果基本一致的细胞保护措施。缺血PC的发现提示：机体缺血状态下，内部天然内源性保护机制的激活对机体的抗损伤反应具有特殊的生物学意义[1]。近年的资料证实PC在大鼠、小鼠、兔、猪心肌缺血中也存在相似的心肌保护作用。国内外相继报道后适应对脑缺血神经元具有保护作用[2,3]。随着研究的深入与扩展，发现药物后适应、缺氧后适应、亚低温后适应等均对脑缺血损伤有一定抵抗作用，但其机制尚未阐明，目前后适应大脑保护涉及的主要信号转导通路有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶 (serine/threonine kinase， Akt)、磷脂酰肌醇-3激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、ATP敏感性钾离子通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)等。

1 后适应的概念

上世纪80年代，由Murry等在开胸的实验犬模型中发现短暂地、间歇地阻断冠状动脉，可以减轻随后长时间缺血所带来的组织损伤[4]，减少随后发生心肌梗死的范围，并且首次提出缺血预适应的概念。但是缺血常常是不可知、不确定的因素，从而限制了缺血预适应用于临床。2003年，Zhao等[2]利用犬的心肌缺血模型，将犬的左冠状动脉前降支结扎，发现同缺血预适应一样，可以减轻再灌注损伤，减小心肌梗死面积(较对照组减小44％)，出现与缺血预适应相似的心脏保护作用，他们把这种现象称之为缺血后适应。随后，多个实验室证实后适应在大鼠、小鼠、兔、猪心肌缺血中也存在相似的心肌保护作用。国内外相继报道后适应对脑缺血神经元具有保护作用[1-3]。而且Ren等[5]将血管再通后即刻至30 min内进行后适应操作定义为快速后适应(rapid postconditioning)，而将在通后数小时至数天进行后适应操作称为延迟后适应(delayed postconditioning)。随着研究领域的拓展，出现了低温后适应、缺氧后适应、药物后适应等新领域。

2 脑缺血后适应的实施方法

2.1大脑中动脉永久性闭塞且双侧颈总动脉临时夹闭/大脑中动脉临时闭塞 此模型目前应用于多个实验，Zhao等[2]、Pignataro等[3]应用大鼠大脑中动脉永久性闭塞+双侧颈总动脉临时夹闭制作脑梗死模型，在双侧颈总动脉夹闭不同时间后放开，之后进行后适应操作，结果发现夹闭颈总动脉30 min，缺血面积减少50％[5]，而阻断颈总动脉60 min后，脑缺血更加严重而保护作用却减弱[2]。当循环次数为10次时，脑缺血面积减少达56％[6]，而只有闭塞和再灌注的循环，脑梗塞面积减少也可达54.9％[5]。Pignataro等[3]通过从颈外动脉向颈内动脉中插入尼龙线临时阻塞大脑中动脉，建立局灶脑缺血后适应模式，当阻塞100 min、放开10 min、阻塞10 min仅循环1次，脑梗塞面积减少了65％。我们新近的研究发现，大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)所致的脑缺血为一种机械性、完全性的血管阻塞，既不利于后适应介导的机械信号的转导，开夹时自颈总动脉进入颅内的血流无法到达缺血区，后适应对局部脑血流(regional cerebral blood flow，rCBF)的改善不甚明显(待发表资料)。可见，用MCAO模型不利于研究后适应的保护作用。

2.2永久性闭塞双侧椎动脉+临时夹闭双侧颈总动脉 该方法又称4根血管阻塞法，既永久性闭塞双侧椎动脉+临时夹闭双侧颈总动脉，由于阻断和再灌注的时间不同，即使循环次数相同，仍然出现了明显不同的保护作用[7]。由于快速后适应的时间窗非常短暂，仅仅是再灌注后数秒到数分钟的时间，对后适应的临床研究限制很大，因此一些学者将目光转向再通时间较长的延迟后适应。在4根血管法制作Wistar大鼠脑缺血模型中，2 d后海马神经元死亡减少了89.9％[8]，但由于实施后适应的时机与临床脑缺血治疗的“时间窗”有较大差距，使得延迟后适应对全脑缺血的保护效果有待明确。

2.3远程缺血后适应 远距离后适应概念是指在缺血后再灌注损伤时给予不同器官短暂的非致死性缺血和再灌注损伤，称为远程缺血后适应(remote ischemic postconditioning)。由Kerendi等[9]于2005年首次提出，证明阻断肾动脉5 min、再灌注1 min之后进行大鼠左冠状动脉再灌注，相对于对照组可以减少50％梗死面积。反复阻断猪的四肢血流实施后适应，在猪的冠状动脉模型中也得到相似结论[10]。李树清等[1]用光化学诱导树鼩(一种低等灵长类)局灶性脑缺血后4 h夹闭缺血侧颈总动脉(5 min循环3次)可使脑缺血72h时海马CA1区rCBF明显增多，达到正常值的56％，且梗塞面积明显缩小[1,8]，从而证明夹闭远离缺血部位的颈总动脉有助于改善海马CA1区的血液供应；同时提出多次短暂闭塞动物的颈总动脉可延长脑缺血治疗“时间窗”的观点。随后，Ren等[11]将大鼠左侧大脑中动脉永久闭塞同时夹闭双侧颈总动脉30 min后放开，开始快速远程后适应，发现梗塞面积减少了67％；在3 h开始的延迟远程后适应，梗塞面积也减少了43％。从而证实远程缺血后适应能够减轻局灶脑缺血的损伤。目前，远程缺血后适应的脑保护作用研究很少，由于远程缺血后适应可以通过对肢体等不重要部位进行干预，从而达到对重要器官的保护，具有较好的临床应用前景。

2.4低温后适应 1995年Colbourne等[12]研究发现脑缺血后低温处理具有长期的保护作用，这种保护作用依赖于延迟低温后处理开始的时间及低温的程度。近年研究认为于脑缺血前、缺血过程中或缺血后早期开始亚低温治疗,可明显减轻因缺血所致的脑损伤，28-33 ℃的亚低温具有确切的神经保护作用。最近，我室采用树鼩脑缺血模型,于缺血6 h时实施局部恒温控温装置使脑温降低并维持亚低温(31-32 ℃)状态1 h，结果发现亚低温后适应组海马CA1区24 h时神经元坏死减少,与超微结构观察结果一致,认为低温后适应具有脑保护作用，并首次提出亚低温后适应的概念[13]。

2.5缺氧后适应 体外细胞研究主要是将分离出来的动物大脑皮质用木瓜蛋白酶分解、研磨弄碎后放在供细胞生存的培养皿上，当用磷酸盐缓冲盐溶液添加0.5％ CaCl2和1.0 mmol/L MgCl2洗涤后，将装有洗涤细胞的培养皿放入缺氧室(85％N2,5％H2,10％CO2,35 ℃)内一段时间，引起氧、葡萄糖缺失(oxygen glucose deprivation,OGD)。OGD恢复则是将细胞从缺氧室中移到氧含量正常的培养皿中。当使用OGD作为后适应体外模型的一个起点，使皮层细胞遭受120 min的OGD后，恢复10 min，接着10 min OGD，结果显著减少了细胞死亡[3]。而薄片培养30 min OGD后，发现可以减少细胞损伤接近40％[14]。由此我们知道后适应开始时间不同及持续时间不同，神经元保护作用也所不同。

2.6药物后适应 药物后适应(pharmacologic postconditioning)[15]是在心肌缺血预适应基础上发展起来的，是指通过药物激发或模拟机体自身内源性保护物质而呈现心脏保护作用。现已有多种药物后适应可对心脏产生保护作用，而对脑的保护作用却研究甚少。Lee等[16]于2008年使用挥发性麻醉剂异氟醚，研究了药物后适应对脑的保护作用。研究者将脑缺血SD大鼠的大脑切片制成离体模型，以体外OGD 15 min为后适应起点，当异氟醚浓度为2％时，神经元损伤减轻；当异氟醚浓度为2.5％时，保护作用消失。异氟醚作用开始时间及浓度影响了对脑的保护作用。最近的研究表明使用七氟烷进行后适应操作，可以减小脑梗塞体积，提高大鼠的学习及记忆能力[17]。

3 脑缺血后适应的信号转导机制

研究显示，脑缺血时由于自由基大量产生，兴奋性氨基酸积聚以及Ca2+超载均可出现细胞信号通路所介导的细胞损伤，包括细胞外MAPK、细胞膜KATP、细胞内Akt及PKC通路，当PI3K/Akt通路受到抑制将直接导致糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)及β-catenin降解，caspases激活，凋亡形成。由于后适应的基本原理在于改善局部脑血流，同时通过机械信号转导与生物信号转导的相互作用，调节细胞局部微环境而发挥保护作用，但有关后适应的更详尽的调节机制仍有待进一步探索。下文简要总结近年来缺血后适应脑保护的Akt、PI3K、MAPK、PKC、KATP等可能信号转导机制。

3.1Akt信号通路 PI3K/Akt信号转导途径是体内最为重要的细胞生存激酶途径之一。研究表明，后适应的神经保护作用是因为PI3K/Akt通路的活化[17,18]。Akt是PI3K最重要的下游底物，Akt磷酸化是PI3K活化的直接结果[19]，当使用渥曼青霉素，一种选择性PI3K抑制剂，可以抑制PI3K增加，可以使后适应的保护作用减弱[17,18]。Pignataro等[3]发现缺血后适应的神经保护效应至少部分与Akt活性有关。之后，用Western blotting证实后适应增强了Akt磷酸化水平，并使用体外激酶含量测定了Akt的活性，发现后适应能使Akt的活性增强[20,21]。当使用PI3K的抑制剂LY294002，后适应保护作用消失[21]，且LY294002抑制了后适应大鼠脑Akt活性得到证实[20]。Akt活性由Akt通路上的许多分子进行调控，其中包括GSK3β。当GSK3β去磷酸化时，其活性会增强并导致β-catenin磷酸化，引起β-catenin降解，最终凋亡形成[2]。后适应限制磷酸化GSK3β增加，而且对神经元的保护而言，高磷酸化的GSK3β并没有起到作用[20]。脑梗死时，有活性的β-catenin减少，但后适应没有减轻这种不利因素，可以说在后适应保护作用中起关键作用的是Akt通路。我室汤諹等[22]的研究证实:PI3K/Akt信号转导途径的活化在缺血后适应保护海马CA1区神经元的机制中可能起着重要作用。由于Akt的活化需Ser-473与Thr-308位点的双磷酸化,Akt-Thr-308活化决定了PI3K/Akt途径的激活。并首次观察到缺血后适应组Akt- Thr-308的活化呈现持续、逐渐增强状态。

3.2MAPK通路 MAPK通路与缺血损伤以及神经元存活关系紧密[23]，它包括细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、p38、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)通路。当JNK活化时脑缺血损伤加重[24]，再灌注后p-JNK短暂增加，JNK通过增加凋亡触发因子的活性，加速凋亡形成。Bcl-2相关死亡蛋白(Bcl-2-associated death protein，BAD)是Akt的重要下游靶点，JNK途径与BAD的活化有关。BAD是PI3K/Akt介导的生存信号途径与JNK死亡信号途径的一个整合检查点，在脑缺血后的缺血中心周围区域BAD决定了细胞的命运。后适应抑制了JNK磷酸化，JNK和P38受到抑制时，可以阻止凋亡形成[23]。通常，脑缺血后细胞外信号调节激酶1/2磷酸化作用(ERK1/2 phosphorylation ，p-ERK1/2)水平上升，但增加的p-ERK1/2是否具有保护作用，仍然是目前争论的焦点。有活性的ERK1/2有利于细胞因子、氧自由基及其它炎症因子产生，这会加重缺血损伤；而且有利于外源性生长因子和雌激素产生，则对神经元起保护作用。有学者认为脑卒中损伤与p-ERK1/2增加有关[25]，后适应增强p-ERK1/2[3],Gao等[20]证实p-ERK1/2在脑卒中1-24 h增加，后适应降低了半暗区中p-ERK1/2的水平，抑制ERK1/2的活性从而起到保护作用。

3.3PKC通路 PKC通路是另一个与脑卒中引起凋亡有关的通路。PKC通路包括δ蛋白激酶C(δ protein kinase C，δPKC)和ε蛋白激酶C(ε protein kinase C，εPKC)。δPKC和εPKC都是PKC家族的同工酶。当δPKC分裂或膜转位时，δPKC活性增加，加快了神经元死亡[26]。δPKC有助于凋亡形成而εPKC抑制凋亡形成[27]，εPKC促进了神经元存活[26]。后适应阻止了脑缺血1h后缺血半暗区内δPKC分裂水平上升(δPKC分裂水平代表δPKC活性)，减少了有害效应；后适应还增加磷酸化δ蛋白激酶C(phosphorylated δPKC，Thr 505；p-δPKC)蛋白水平，加强了εPKC的有益作用[20]。

3.4KATP通道 εPKC可以激活KATP通道，引起神经保护。细胞内有2种ATP敏感性钾离子通道，1种位于肌浆，1种位于线粒体。有学者利用非选择性KATP通道阻滞剂格列本脲可以使后适应保护作用消失[28],也有用5-羟基癸酸(5- hydroxydecanoic acid，5HD)使二氮嗪的后适应保护作用消失[29]，从而认为 KATP通道与后适应保护机制有关[16]，后适应对线粒体ATP敏感性钾离子通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoKATP)的开放有益[28]。

3.5机械信号转导通路 通过后适应对血栓形成脑缺血与MCAO脑缺血实施效果的比较，证明夹闭远离缺血部位的颈总动脉有助于改善脑血栓形成动物海马CA1区的血液供应，其PC的机制可能包括“机械信号转导”和体内血液重新分布两方面。前者可能与夹闭血管及开夹时血流冲击所产生的机械信号转导有关；后者则由于腹腔内脏与脑血管α-受体分布不同，以及夹闭颈动脉引起减压反射的加压效应的结果[1]。

4 结语

脑缺血后适应的实验研究方法各有特点，无论夹闭双侧还是单侧颈总动脉，最后都得到了脑保护作用[5]。循环次数、阻断持续时间不同，对脑的保护作用也不同，而且，快速后适应的脑保护作用与循环次数、每个循环中缺血与再通持续的时间以及后适应开始的时间息息相关[6]。值得一提的是，我室首创的光化学诱导局灶脑缺血模型，由于不需开颅，避免了开颅手术闭塞脑血管后对脑组织的机械损伤，梗死部位及范围可以通过光照强度和光敏剂浓度控制，重复性好，能较好地模拟人类缺血性脑卒中的发生及发展过程，是一个较为理想的脑缺血后适应模型。脑缺血后适应的机制目前尚不清楚，其保护机制与Akt信号通路、MAPK通路、PKC通路、KATP通道、机械信号转导通路的作用有关，最终减少凋亡形成，保护缺血脑组织。

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Progressinbrainprotectionwithischemicpostconditioning

ZHANG Chuan-rao,LI Shu-qing
(DepartmentofPathophysiology,KunmingMedicalCollege,Kunimng650500,China.E-mail:shuqing591@hotmail.com)

Cerebrocardiovascular diseases and stroke are serious threat to human health.More attentions focus on cerebral ischemia and the publications suggest that ischemic preconditioning prevents ischemic myocardium from ischemia/reperfusion injury,soon followed by preconditioning against cerebral ischemic injury.However,in clinical management,ischemia is often unpredictable.In recent years,researchers found that ischemic postconditioning and ischemic preconditioning obtained the similar effects on brain protection after cerebral ischemia.The endogenous protective mechanisms play a key role in protecting against brain ischemic injury.As a novel manner to protect against brain injury,postconditioning attenuates the infarct volume following brain ischemia/reperfusion and prompts the neurological recovery by prolonging the therapeutic time window.This article reviews the processes of ischemic,hypoxia,hypothermia and pharmacologic postconditioning,and the possible brain protection mechanisms activated by the signal transduction of serine/threonine kinase (Akt),phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K),mitogen-activated protein kinase (MAPK),protein kinase C (PKC),and ATP-sensitive potassium channel (KATP) pathways.

Brain ischemia; Postconditioning; Brain protection

1000-4718(2011)05-1025-05

R743.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.038

2010-11-01

2011-03-09

国家自然科学基金资助项目(No.30660056;No.30971171);教育部博士点专项科研基金资助项目(No.20050678008)

△通讯作者 Tel:0871-6670817; E-mail: shuqing591@hotmail.com