王舒新 李勇
瘦素为正处在研究阶段的对关节软骨的损伤修复可能有积极作用的药物。本研究旨在构建藻酸盐-软骨细胞三维培养体系的基础上,研究瘦素对软骨细胞及其细胞外基质的影响,并探讨其相关基因表达的变化,以期为软骨损伤和退变寻找一种新的治疗手段。
1.1 材料 软骨细胞取自2只健康4周龄Sprague-Dawley大鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)膝关节,体重(100±15)g,雌雄不限,清洁级。
1.2 主要试剂 胎牛血清(天津血研所),DMEM培养基、胰蛋白酶(Sigma公司),青霉素、链霉素(华北制药有限公司),胶原酶Ⅱ(Sigma公司),SABC试剂盒(博士德公司),胰酶(Gibco公司),海藻酸钠粉剂(Fluka公司)。
1.3 SD大鼠的软骨细胞分离及扩增 取4周大鼠膝关节软骨,剪成<1mm3大小,经0.25%胰酶消化后加入0.2%Ⅱ胶原酶5 ml、37℃恒温水浴振荡箱下消化60~90 min,离心后,收集骨髓中的单个核细胞,接种于25 cm2培养瓶中,3 d后换液,此后每2~3天换液。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。待原代细胞达80%融合后,用0.25%的胰蛋白酶消化,按1∶2传代。
1.4 软骨细胞的鉴定 软骨细胞呈星形、多角形,铺路石样生长;HE染色观察软骨细胞形态,Ⅱ型胶原免疫组织化学检测方法观察软骨细胞中Ⅱ型胶原分泌情况。
1.5 与海藻酸钠结合成软骨-藻酸钙复合体 将P2代细胞消化离心收集,使用低黏滞度的海藻酸钠溶液悬浮细胞,调整细胞密度至5×106/ml,充分混匀。软骨细胞/海藻酸钠混合物在102 mmol/L CaCl2中聚合约15 min形成固体小珠(图1),于完全培养基中培养,加入不同浓度瘦素,依据培养液中不同浓度瘦素(0、1、10、100、1 000 ng/ml)分为 A、B、C、D、E 共5 组,将海藻酸钙珠置于5%CO2饱和湿度、37℃培养箱中培养,每日或隔日换液。分别于培养24 h取海藻酸钙凝珠进行以下检测:(1)MTT检测法检测细胞活性;(2)Realtime PCR定量研究IGF-ⅠmRNA表达,分析评价软骨细胞分泌的功能。
图1 软骨细胞/海藻酸钙凝珠
1.6统计学分析应用SPSS 13.0统计软件,计量资料以±s表示,采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 细胞形态 刚提取的软骨细胞悬液,在倒置显微镜下观察为很多“星星”状的亮点;原代软骨细胞24 h后开始逐渐贴壁,轻摇培养瓶,细胞仍固定于瓶底;软骨细胞形态呈卵圆形贴壁生长,个别软骨细胞开始伸出伪足;48 h后,软骨细胞贴壁数量逐渐增加,同时见有部分细胞分裂增殖;细胞培养7 d后,软骨细胞长满瓶底,呈铺路石样改变,融合达80% ~90%,软骨细胞此时呈圆形、多角形、或星形生长。传代后的2、3代软骨细胞形态仍为的圆形、多角形或星形,并保持很强的立体感;而第4代后,软骨细胞形态逐渐发生改变,呈长梭形,立体感减弱、,有少量类似成纤维样细胞,至5、6代,梭形细胞明显增多、类似成纤维细胞呈杂草状排列。见图2~5。
图2 平面培养下2代软骨细胞形态
图4 平面培养下4代软骨细胞形态
图5 平面培养下5代软骨细胞形态
2.2 HE染色 对2、3代软骨细胞行HE染色,显微镜下观察见,2代软骨细胞贴壁生长,细胞呈星形、多角形、圆形,可见伪足伸出,细胞核为圆形,胞质内容丰富,红染、着色较深。见图6。
图6 软骨细胞(HE×100)
2.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色 传代软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性表现,胞浆明显呈棕黄色,细胞核则被染成浅蓝色。第2、3代软骨细胞胞浆Ⅱ型胶原免疫组织化学染色较深,第4代开始减弱、但仍呈阳性表现、局部可呈阴性表现,第5代显著减弱。见图7~10。
图7 2代软骨细胞Ⅱ型胶原(免疫组化×100)
图8 3代软骨细胞Ⅱ型胶原(免疫组化×100)
图9 4代软骨细胞Ⅱ型胶原(免疫组化×100)
图10 5代软骨细胞Ⅱ型胶原(免疫组化×100)
2.4 MTT检测细胞活性 5组软骨细胞的OD值分别为(0.104±0.004)、(0.114±0.003)、(0.207±0.009)、(0.160 ±0.002)、(0.143±0.005),C组OD值最高,与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。
2.5 RT-PCR法检测软骨细胞IGF-Ⅰ的表达
2.5.1 mRNA抽提的验证:核酸蛋白检测仪:紫外可见光分光光度计检测RNA浓度和纯度,经检测抽提的RNA纯度较高,无蛋白质、DNA等杂质干扰。
2.5.2 扩增曲线和溶解曲线分析:所有样本均可见S形扩增曲线;被检测基因的扩增产物均呈明显单一波峰,无明显杂峰。2.5.3 RT-PCR法软骨细胞IGF-Ⅰ的表达作用的测定:瘦素浓度在1~1 000 ng/ml时,对软骨细胞表达IGF-Ⅰ均有明显促进作用,与A组比较差异均有统计学意义(P<0.01),C组比值最高,与其他各实验组比较均有统计学意义(P<0.01)。见表1。
表1 三维培养下瘦素刺激软骨细胞表达IGF-Ⅰn=5,△CT,±s
表1 三维培养下瘦素刺激软骨细胞表达IGF-Ⅰn=5,△CT,±s
注:与A组比较,*P <0.01;与 B组比较,#P <0.01;与 C组比较,△P <0.01
组别 IGF-Ⅰ/GAPDH A组3.627±0.940 B组 6.697±0.132*C组 8.573±0.332*#D组 7.753±0.892*△E组 5.752±0.149*△
瘦素(leptin)是由脂肪细胞分泌一种蛋白质类激素,能参与调节能量代谢、食欲和生长发育。近年来发现,人关节软骨细胞有瘦素受体表达,较低浓度的瘦素可促进关节软骨细胞增殖并可促进软骨细胞外基质(Ⅱ型胶原和蛋白多糖)的合成[1]。我们前期研究发现[2],在大鼠膝关节腔内注射低浓度瘦素,可以诱导软骨细胞合成和分泌软骨修复因子IGF-Ⅰ。Maor等[3]也发现,较低浓度的瘦素可以剂量依赖性的方式刺激软骨细胞前体细胞区增宽,使得软骨组织的整体体积增加,并使软骨组织合成的硫酸软骨素明显增加。
本实验中,通过对1~5代软骨细胞分别行HE染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后,比较得出2、3代软骨细胞更加接近原代细胞可作为实验用种子细胞;通过MTT法及RT-PCR法对不同浓度瘦素干预下的三维环境中大鼠软骨细胞增殖情况及相关基因表达产物进行比较证实:与A组(空白组)比较,较低浓度的瘦素可以促进软骨细胞增殖、活性及相关基因的表达(P <0.05),这与Maor等[3]研究结果是一致的;同时还发现随着瘦素浓度增加软骨细胞活性及基因表达产物也有所上调,瘦素为浓度10 ng/m l时最高(P<0.05),然而当瘦素浓度继续增加时,软骨细胞活性及基因表达产物反而成下调趋势;此外与平面培养比较,软骨细胞增殖、活性及相关基因的表达都有上升趋势。本实验结果说明:(1)瘦素可以促进软骨细胞增殖、活性及相关基因的表达。机制可能是软骨细胞表面存在长型瘦素受体表达,瘦素直接作用于该受体,通过JAK-STAT途径激活从而刺激蛋白多糖和胶原合成[4]。然而随着瘦素浓度继续增加软骨细胞活性及基因表达产物反而成下调趋势,可能与高浓下产生的 JAK/STAT途径抑制因子(如 SOCS-3、PTP1B、PIAS3)的数量增加有关[5-7]。这些机制还需要我们在今后的研究中进一步证实和完善。(2)与平面培养比较,软骨细胞增殖、活性及相关基因的表达都有上升趋势,原因可能是支架的应用使软骨细胞的生存环境更接近体内环境,传代的软骨细胞仍能生长在其自身分泌的细胞外基质所形成的三维网状空间中,这有利于较长的时间内保持软骨细胞的表型及功能。我们研究最终目的是将体外培养的软骨细胞回植,修复体内已被破坏的关节软骨,而软骨细胞的移植需要载体。理想的细胞移植载体应具备以下5个条件:(1)良好的组织相容性,载体材料对种子细胞和邻近组织无免疫源性;(2)具有三维空间结构,载体材料必须是高度多孔的,从而具有很大的内表面积,这有利于细胞的植入和贴附及细胞因子的渗入;(3)载体具有良好的表面活性,有利于细胞的贴附,并为细胞在其表面生长增殖分泌基质提供良好的微环境;(4)生物可降解性和适度降解率,载体在组织形成过程中逐渐分解吸收,而不影响新形成组织的结构和功能,降解率应与组织生长率相适应;(5)载体材料可被加工成所需要的各种形状,并有一定的机械强度,在植入体内后一定时间内仍可保持其形状,使新形成的组织具有一定的外形[8]。本实验选择藻酸钙凝胶支架是因为它除具备以上支架共同特点外,藻酸钠在体内通过酶解作用分解,产物对人体无不良反应,食品和药品管理局已批准藻酸盐用于制作人类的食品添加剂及伤口敷料,而且与其他聚合物相比,价格低、来源丰富、易塑形、具有更好的亲水性,易于细胞吸附,营养物质易于渗透。研究证实,成骨细胞成、纤维细胞和软骨细胞可在藻酸钙水凝胶中成活并形成细胞外基质[9]。
总之,海藻酸钙凝胶组织工程材料,能够满足组织工程材料的要求,能与软骨细胞完全嵌合,是一种良好的软骨组织工程材料,瘦素又能进一步促进软骨细胞增殖、活性及相关基因的表达,这些为下一步进行人类关节软骨修复提供参考及依据。
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2 赵文国,王永贵,贾鹏,等.瘦素对大鼠关节软骨IGF-Ⅰ表达的影响.江苏医药,2008,34:820-822.
3 Maor G,Rochwerger M,Segev Y,et al.Leptin acts as a growth factor on the chondrocytes of skeletal growth centers.JBone Mine Res,2002,17:1034-1043.
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