小鼠角膜组织石蜡切片制作方法的探讨△

张胜男 夏丽坤 胡 媛

在小鼠角膜石蜡标本制作过程中,由于角膜组织的特殊性,是较为致密的组织,并且角膜每一层之间的连接不是非常紧密,这就使得石蜡切片的制作存在一定的问题。而常规方法制作切片过程中又极易出现眼球变形、角膜各层次结构分离等问题。在常规的固定、脱水过程中角膜各层组织由于收缩率的不同容易造成组织分离,特别是造成角膜的分离甚至脱落,组织结构疏松、细胞着色不均。本研究,我们结合了角膜的结构特点及以往的文献报道[1-5],比较了几种不同的固定方法,总结出了比较适合小鼠角膜组织的固定方法,能在不影响免疫组织化学特性的前提下有效提高小鼠角膜组织切片的质量。现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物和固定液 取4～6周龄雌性BALB/ C小鼠 30只,体质量 15～18 g(中国医科大学动物实验室提供)。固定液1(FAA固定液):体积分数95%乙醇85m L,体积分数 10%中性甲醛10 m L,冰醋酸5mL充分混匀[6]。固定液 2:多聚甲醛 4 g,加入0.1mol·L-1磷酸缓冲液80m L,加热至60℃左右,持续搅拌,使粉末完全溶解,加少许 1 mol·L-1NaOH澄清。待冷却后,加冰醋酸5mL、丙酮10mL,用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液补足至100 mL[1]。固定液3:无水乙醇60m L,体积分数10%中性甲醛10 m L,冰醋酸10mL,氯仿20mL,充分混匀。

1.2 取材和固定 脱颈法处死小鼠,手术显微镜下取出眼球,用角巩膜剪剪去眼球周围组织,按不同的固定方法分为 3组:A组 20只眼球,用固定液 1固定;B组20只眼球,用固定液2固定;C组20只眼球,用固定液 3固定。所有标本固定 2 h后,在手术显微镜下去除巩膜、虹膜、晶状体,完整保留角膜。继续将角膜标本置于固定液中。24 h后进行脱水,体积分数分别为 70%、80%、90%乙醇各脱水 1 h,体积分数 95%乙醇脱水1 h。无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ各脱水10 min,二甲苯透明 3～4 min,60℃石蜡浸蜡 2 h,矢状位包埋眼球。切片厚 4μm,60℃烤片1 h。

1.3 HE染色 各组标本取切片进行HE染色。常规石蜡切片脱蜡至水,苏木素染色 10 min,体积分数1%盐酸乙醇分化1min,自来水返蓝30min,10 g· L-1伊红染色 40 s,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察。

1.4 免疫组织化学检测

1.4.1 试剂及显色试剂盒 一抗工作液HVEM (Herpes virus entrymediator;抗体购自Santa Cruz Biotechnology)。S-P超敏试剂盒购自福州迈鑫生物技术公司。PBS、DAB显色剂购自北京中杉公司。已有研究发现HVEM在正常小鼠角膜内皮及上皮中有表达[7]。

1.4.2 操作步骤 常规脱蜡和水化组织片后,用体积分数3%H2O2孵育10min。再次水化后,高压修复2min。PBS(pH 7.4)洗涤3次,每次3min。加入相应动物非免疫血清封闭30 min,然后加以PBS稀释配制的一抗工作液(CD160稀释倍数为体积比1∶400,LIGHT稀释倍数为体积比1∶400,BTLA稀释倍数为体积比 1∶200),4℃下过夜。PBS洗涤后,加以生物素标记的IgG,室温下放置30min。PBS洗涤后,加以SABC试剂室温下放置30 min。再以PBS洗涤后,用DAB染色。镜下控制显色强度,显色完成后苏木素复染10min,自来水返蓝20 min,常规脱水后封片。以PBS替代一抗做阴性对照。光学显微镜下观察并照相。

2 结果

2.1 大体观察 肉眼可以看到小鼠角膜经过固定和脱水后A组部分角膜皱缩变形;B组、C组角膜外形均无明显变化,无皱缩和凹陷变形,能保持原有的形态。

2.2 HE染色 A组标本染色鲜明,角膜各层结构清楚,但是角膜基质层出现明显脱水现象,角膜成纤维细胞间出现较大空隙(图1)。B组标本未见明显脱水现象,但角膜结构过度压缩,出现明显的脱片现象,不能清晰显示角膜各层结构(图2)。而C组标本可观察到角膜各层组织结构完整,无明显结构改变,未见脱片及基质层脱水现象,角膜各层组织结构清晰无裂隙;无细胞过度收缩和膨胀,细胞核仁、核膜清晰,染色质均匀,色泽亮丽,颜色对比明显(图3)。

2.3 免疫组织化学染色 3组无明显差异,角膜上皮及内皮细胞均显示HVEM阳性。但是A组标本中组织结构较疏松,散在很多裂隙,是基质层细胞明显脱水的表现(图4)。B组标本中角膜组织明显脱片并且出现组织结构的过度压缩,影响结果的观察(图 5)。而 C组标本角膜组织结构紧密,染色均匀,组织的免疫组织化学特性较好(图6)。

3 讨论

小鼠角膜的三层结构为:上皮层、基质层、内皮层。小鼠角膜属于较为致密的组织,而且这三层角膜结构的密度并不完全相同,对染液及不同浓度乙醇的处理发生的反应不同,将会造成组织间相互影响,导致最终病理切片的脱水,甚至脱片。国内病理技术工作者在眼球制片技术上改进方法较多[1-2],但步骤繁琐,材料要求特殊、购置困难且所用部分试剂毒性大、费时。

在小鼠角膜病理制片过程中,FAA固定液中含有冰醋酸和乙醇,冰醋酸对组织的穿透力强,但会使组织膨胀,一般不单独用于固定组织,并且固定时间要短,乙醇对组织有收缩作用,可以抵消冰醋酸对组织的膨胀[3]。本次我们的研究发现,FFA固定液固定后的标本脱水情况较为严重,造成了角膜组织的过度收缩。出现这种情况可能是由于体积分数 95%乙醇收缩作用太强,过多地抵消了冰醋酸对组织的膨胀作用。固定液 2中加入丙酮,且本固定液较为温和,组织收缩不明显,但是角膜在经过了脱水后,会变得更为致密,导致了脱片情况的发生。固定液 3中无水乙醇有强烈的收缩作用,体积分数 10%中性甲醛固定液渗透压较高,在固定过程中容易使角膜水分析出,而冰醋酸可以抵消无水乙醇的收缩作用,氯仿可以抵消一部分中性甲醛的渗透压,达到较好的角膜固定效果。固定液 3在小鼠角膜病理制片过程中的效果明显优于FFA固定液及固定液 2。并且方法操作较为简单,即使在使用普通试剂的情况下,也能达到较为理想的效果,切片完整,角膜各层组织清楚,是固定小鼠角膜组织、制作病理切片的较好方法。

Figure 1 HE staining of cornea fixed in fixation fluid 1showed corneal tissues were dehydrated(HE,×400).Figu re 2 HE staining of cornea fixed in fixation fluid 2 showed corneal sections were flaked and broke into pieces(HE,×400).Figure 3 HE staining of cornea fixed in fixation fluid 3 showed the structures were clear(HE,×400) 图1 固定液1固定角膜组织HE染色,角膜组织脱水(HE,×400)。图2 固定液2固定角膜组织HE染色,角膜组织脱片(HE,×400)。图3 固定液3固定角膜组织HE染色,角膜组织结构清晰(HE,×400)

Figure 4 Immunohistochemistry detected HVEM in cornea fixed in fixation fluid 1(×400).Figure 5 Immunohistochemistry detected HVEM in cornea fixed in fixation fluid 2(×400).Figure 6 Immunohistochem istry detected HVEM in cornea fixed in fixation fluid 3(×400) 图4 固定液1固定角膜免疫组织化学HVEM染色(×400)。图5 固定液2固定角膜免疫组织化学HVEM染色(×400)。图6 固定液3固定角膜免疫组织化学HVEM染色(×400)

1 付 霞,刘金华,梁秀就.大鼠眼球标本石蜡切片的改良制作方法[J].眼科新进展,2007,27(6):417-419.

2 易少华,陈晓瑞,邓伟年,饶广勋.大鼠眼球标本石蜡切片的制作方法[J].临床与实验病理学杂志,2005,20(3):359.

3 张文忻,李永平,林健贤,聂 莉,张卉颖.冰醋酸固定液对视网膜组织固定效果的探讨[J].眼科学报,2006,22(2):112-114.

4 罗灿峤,梁英杰,吴惠群,钟觉民,梁惠珍.小鼠眼球标本固定液及制片方法的改进[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2007,16 (1):124-125.

5 胡宏慧,曹 晖.大鼠眼球标本石蜡制片方法的探讨[J].眼科新进展,2001,21(6):403.

6 程 钧,万 磊,刘 廷,刘伟吉,董晓光.小鼠视网膜组织石蜡切片制作方法的探讨[J].眼科新进展,2009,29(3):161-164.

7 Kovacs KS,Tiw ari B.Ex pression of herpes virus entry m ediato r (HVEM)in the co rnea and trigem inal ganglia of normal and HSV-1 in fected m ice[J].Cu rr Eye Res,2009,34(10):896-904.