黑麦草酸性洗涤木质素/中性洗涤纤维、长度对山羊采食行为及瘤胃液pH和纤维素酶活性的影响

高 洋 徐 明 刘南南 赵向辉 刘婵娟 姚军虎

(西北农林科技大学，杨凌 712100)

粗饲料是反刍动物饲粮的主体，可为反刍动物提供最基本的能量和蛋白质等养分，同时饲粮中适宜的粗饲料含量可刺激咀嚼，增加唾液量，维持瘤胃液pH及乳脂稳定，使动物保持健康［1-2］。NRC(2001)［3］认为中性洗涤纤维(NDF)是表示纤维性饲料的最好指标。其中，粗饲料源中性洗涤纤维(forage NDF，FNDF)在维持动物机体健康方面起着决定性的作用［2-4］。Mertens［4］提出了物理有效中性洗涤纤维(physically effective NDF，peNDF)的概念，认为饲料NDF含量、牧草长度及韧性对动物健康有影响。NDF由纤维素、半纤维素和木质素构成，其中木质素在瘤胃中不能降解，但高含量木质素可增加饲料韧性，进而可能影响动物的采食行为以及瘤胃发酵。目前关于牧草长度、NDF含量对瘤胃健康的影响已有较多研究［4-5］，但有关NDF组分对山羊采食行为、瘤胃发酵特性等方面影响的研究则较少。本试验选择不同生长期的黑麦草，切割成不同长度作为粗饲料，研究黑麦草酸性洗涤木质素/中性洗涤纤维(ADL/NDF)、长度对山羊采食行为、瘤胃液pH和纤维素酶活性的影响，为评价黑麦草营养价值及其合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用初花期黑麦草(ryegrass at early-bloom stage，REB)和盛花期黑麦草(ryegrass at full-bloom stage，RFB)，分别切割成20 mm(93QS-218，广东佳农)或粉碎成5 mm(9FQ-40A，广州未来)理论长度，制备成4种粗饲料。4种粗饲料营养水平见表1。初花期黑麦草制成的粗饲料干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗灰分和非纤维性碳水化合物(NFC)含量显著较低(P ＜0.05)，NDF、酸性洗涤纤维(ADF)和 ADL含量显著较高(P＜0.05)。黑麦草生长期、长度对DM和ADL存在交互作用(P ＜0.05)。

表1 4种粗饲料营养水平(干物质基础)Table 1 Nutrient levels of the four roughages(DM basis) %

1.2 试验动物及试验设计

选用4只体重(40.0±1.8)kg安装有瘤胃瘘管的健康成年山羊，采用两因素4×4拉丁方设计将试验羊分为4个处理。根据FNDF相同设计粗饲料在饲粮中比例，设计4种试验饲粮。因素1、2分别为饲粮中粗饲料 ADL/NDF(低、高)、长度(20、5 mm)。参照 NRC(2007)［6］推荐的干奶期奶山羊营养需要标准设计饲粮，营养水平满足或超过40 kg干奶期奶山羊营养需要，试验饲粮组成及营养水平见表2。

1.3 饲养管理

试验羊单笼(0.75 m ×1.50 m)饲养，全天24 h光照，每天饲喂2次(08:00和20:00)混合饲粮，自由饮水。试验每期20 d，其中预试期13 d，正试期7 d。每期试验结束后直接进入下一期。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 粗饲料和饲粮长度分布

正试期收集各处理粗饲料和饲粮各50 g及全部剩料，测定长度分布［7］及营养水平［8］。长度分布用有 3 个筛层(19.00、8.00 和 1.18 mm)、1 个筛底的宾夕法尼亚筛测定，各筛层peNDF由相应的物理有效因子(physically effective factor，pef)乘以 NDF 含量获得［2］。

1.4.2 采食量和采食行为

正试期每天记录饲喂量、剩料量、采食量。记录正试期干物质采食量(DM I)。

正试期第3～4天，在连续的24 h内以5 m in为间隔单位记录采食、反刍和咀嚼时间。1次采食停止后，20 m in内不重新采食，认为采食停止;1次反刍停止后，5 m in内不重新反刍，认为反刍停止［11］;咀嚼时间为采食时间、反刍时间之和。

表2 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 2 Composition and nutrient levels of trial diets(DM basis) %

择食能力(sorting activity，SA)按以下公式计算:

式中:SAn为筛层n的择食能力，n1为筛层n干物质采食量，n2为筛层n干物质预测采食量。

SAn等于100%代表没有挑食，小于100%表示厌食，大于100%表示喜食［12］。

1.4.3 瘤胃液 pH

正试期的第1～2天，采用pH电极(IP-600-10，JENCO，美国)、pH 转换器(691，JENCO，美国)和记录仪连续监测山羊瘤胃液pH［9-10］，每5 m in测定1次，记录每天 pH＜6.0及pH＜5.6的持续时间。

1.4.4 瘤胃液纤维素酶活

正试期第7天于08:00(饲喂前)、12:00、16:00、20:00(饲喂前)、24:00分别从瘤胃的前面腹部、尾端腹部、中间和前边背部收集瘤胃内容物，准确称取100 g放入带封口的塑料袋，加100 m L磷酸缓冲液(pH 6.0，50 mmol/L)，双手适度揉搓5 m in，使内容物与缓冲液充分混合，用2层纱布过滤，滤液分装于3个10 m L离心管中，-80℃保存。

测量时，取出冷冻样品室温解冻，取20 m L立即在冰浴下进行超声波细胞破碎处理(¢6 mm，400 W，处理30 s、间歇30 s，共 3 次)，所得细胞破碎液作为原酶液。采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定羧甲基纤维素酶、水杨苷酶、木聚糖酶和微晶纤维素酶的活性［13］。酶活单位(IU)的定义为每分钟每毫升酶液作用于底物生成的还原糖量(μmol)。

1.5 数据分析

采用SPSS 17.0中的GLM模块进行方差分析，Duncan氏法多重比较，以 P＜0.05作为差异显著性判定标准，0.05≤P＜0.10时，认为存在显著差异性的趋势。

2 结果

2.1 粗饲料、饲粮长度分布和peNDF

由表2可见，黑麦草生长期不影响其制成粗饲料在各筛层的干物质分布和8.00、1.18 mm层的pef(P＞0.05)，但盛花期黑麦草制成粗饲料8.00、1.18 mm 层的peNDF显著高于初花期(P＜0.05)。黑麦草长度对制成粗饲料在各筛层干物质分布有显著影响(P＜0.05)，增加黑麦草长度，制成的粗饲料＞8.00 mm层上的干物质含量显著提高(P＜0.05)，相应≤8.00 mm 层上的干物质含量显著降低(P＜0.05);增加黑麦草长度，显著提高了制成粗饲料 8.00、1.18 mm 层 pef和peNDF(P＜0.05)。黑麦草生长期、长度对制成粗饲料8.00 mm层peNDF存在交互作用(P＜0.05)。

表3 粗饲料长度分布和物理有效中性洗涤纤维(干物质基础)Table 3 Particle sizes distribution and peNDF of the roughages(DM basis)

由表4可见，黑麦草ADL/NDF不影响饲粮的长度分布和pef、peNDF(P＞0.05)。增加黑麦草长度，可显著增加饲粮＞8.00 mm层上的DM含量，相应显著降低 ＞1.18～8.00 mm 层上的 DM含量(P ＜0.05)，显著增加 8.00 mm 层 pef、peNDF(P ＜0.05)。

2.2 山羊采食量和采食行为

由表5可见，减小黑麦草长度可显著提高山羊的DM I(P＜0.05)，显著提高采食时间、显著降低咀嚼和反刍时间(P＜0.05)。山羊喜食19.00、8.00 和 1.18 mm 层的饲粮(SA ＞100%)，厌食筛底层饲粮(SA＜100%)。饲粮高粗饲料 ADL/NDF显著增加了山羊对饲粮19.00 mm层 SA(P＜0.05);减小粗饲料长度显著增加了山羊对饲粮8.00 和1.18 mm 层的 SA(P ＜0.05)，降低了筛底层 SA(P ＜0.05)。

2.3 山羊瘤胃液pH

由表6可见，饲粮黑麦草ADL/NDF影响瘤胃液平均pH(P=0.05)，高ADL/NDF黑麦草提高山羊瘤胃液平均pH(P=0.05);pH＜6.0的持续时间显著缩短(P＜0.05);不影响瘤胃液pH＜5.6的持续时间(P＞0.05)。增加黑麦草长度，显著提高瘤胃液平均pH并显著降低pH＜6.0的持续时间(P＜0.05)，有降低 pH ＜5.6的持续时间的趋势(P＜0.10)。黑麦草ADL/NDF、长度对瘤胃液pH不存在交互作用(P＞0.05)。

2.4 山羊瘤胃液纤维素酶活性

由表7可见，高ADL/NDF黑麦草显著提高山羊晨饲后12和16 h瘤胃液微晶纤维素酶、4 h水杨苷酶和8 h木聚糖酶的活性(P＜0.05)。增加黑麦草长度，显著提高了山羊晨饲后8和16 h的瘤胃液微晶纤维素酶、8 h羟甲基纤维素酶和4 h的水杨苷酶的活性，但降低了晨饲后16 h的羟甲基纤维素酶活性(P＜0.05)。黑麦草ADL/NDF、 长度对各种酶活性不存在交互作用(P＞0.05)。

表4 饲粮长度分布和物理有效中性洗涤纤维(干物质基础)Table 4 Particle sizes distribution and peNDF of the diets(DM basis)

表5 饲粮黑麦草ADL/NDF、长度对山羊干物质采食量和采食行为的影响Table 5 Effects of the ADL/NDF and length of ryegrass on DM Iand eating behavior of goats

各组4种纤维素酶活随时间变化趋势一致，均为先降低后升高。微晶纤维素酶、羟甲基纤维素酶与水杨苷酶的活性均在晨饲后4 h降到最低，而达到最高值的时间不一致。

表6 饲粮黑麦草ADL/NDF、长度对山羊瘤胃液pH的影响Table 6 Effects of the ADL/NDF and length of ryegrass on rum inal pH in goats

表7 饲粮黑麦草ADL/NDF、长度对山羊瘤胃液纤维素酶活的影响Table 7 Effects of the ADL/NDF and length of ryegrass on rum inal cellulase activities in goats

3 讨论

3.1 不同生长期、长度黑麦草制成粗饲料和饲粮的长度分布

Mertens［4］认为饲料 peNDF 与长度和 NDF 含量成正比，Yang 等［14］与David 等［15］的研究也证明了以上观点。Beauchem in等［16］通过3次切短处理，得到长、中、短3个长度的玉米青贮，利用宾夕法尼亚筛确定其 pef分别为 0.84、0.73和 0.67，peNDF含量分别为 11.5%、10.3% 和 8.9%。本试验中，黑麦草长度对饲粮8.00 mm层 pef及peNDF的影响与上述研究一致，但黑麦草长度对饲粮1.18 mm层pef和peNDF影响不显著，主要是因为本试验的长度处理使饲料较多在滞留在19 .00 和8.00 mm 层。

3.2 饲粮黑麦草ADL/NDF、长度对山羊采食量和采食行为的影响

奶牛的DM I及采食行为受粗饲料长度、粗饲料种类、精饲料营养水平和管理实践等因素的影响［17-18］。Maulfair等［19］报道，当奶牛饲粮中依次含有 1.5%、6.5% 、8.6% 和 11.7% 的 ＞ 26.9 mm的长度时，每天的DM I线性降低。Kononoff等［20］研究也证明了降低饲料长度，DM I增加。本研究与上述报道一致。Kononoff等［7］认为这是因为减小饲料长度，缩短了在瘤胃滞留时间，从而降低了瘤胃饱和度。关于粗饲料ADL/NDF对DM I影响的研究较少，构成NDF的各组分在瘤胃中的降解特性不同，因此NDF组成可能会通过影响饲粮在瘤胃中的消化率和滞留时间进而影响DM I，但本研究中未观察到以上现象。Teimouri等［21］研究显示，增加苜蓿干草长度，极显著提高反刍和咀嚼时间，显著提高采食时间。曾银等［22］也发现，随苜蓿干草长度增加，奶牛采食、反刍和咀嚼时间均显著增加。本研究与以上研究一致。但Yang等［2］研究显示，苜蓿青贮长度对奶牛采食、反刍和咀嚼时间影响不显著。Hosseinkhani等［23］发现增加泌乳前期奶牛采食的干草长度，显著增加反刍和咀嚼时间，而对采食时间没有影响。造成以上差异的原因可能是不同研究中采用的粗饲料种类的长度不同所致。动物采食充足且营养平衡的饲粮是维持健康和获得最佳生产效益的基础，但研究显示泌乳奶牛实际摄取的饲粮与设计饲粮不完全相同［24］。在本试验中采用的2种长度的粗饲料，山羊喜食的20 mm的粗饲料，这与赵向辉等［10］关于苜蓿草对山羊的报道一致，而与Hosseinkhani等［25］对奶牛的研究结果不一致，主要原因可能是2种动物的采食习性不同。而同一筛层饲粮中，山羊喜食5 mm黑麦草组饲粮，具体原因有待进一步探讨。

3.3 饲粮黑麦草ADL/NDF、长度对山羊瘤胃液pH的影响

Krehbiel等［26］认为瘤胃液 pH 低于 6.0 时，动物处于亚急性瘤胃酸中毒(subacute rum inal acidosis，SARA)，Keunen 等［27］将 pH 5.6 作为瘤胃是否处于SARA的界限。保持奶牛饲粮适宜的长度，可维持瘤胃内环境健康，防止发生 SARA［28］。Yansari等［29］用 含 有 长 度 为 7.83、4.04 和1.14 mm苜蓿干草的3种饲粮饲喂9头泌乳中期的荷斯坦奶牛，结果显示瘤胃液pH随长度的增加而增加。本试验中增加黑麦草长度，显著增加瘤胃平均pH和降低pH＜6.0的持续时间，与上述研究结果一致。Boon等［30］认为饲粮中部分成分不能被瘤胃消化，是由于植物生长后期的木质化，木质素使微生物产生的酶很难接触到细胞，降低细胞的降解性。本试验显示ADL/NDF显著影响瘤胃液pH，采食高ADL/NDF饲粮能更好的维持瘤胃液pH，这可能是因为高木质素含量抑制瘤胃发酵所致;同时，较高木质素含量改变了饲粮韧性，因此可能会通过促进咀嚼增加唾液产量，从而对瘤胃液pH具有一定的缓冲作用。

3.4 饲粮黑麦草ADL/NDF、长度对山羊瘤胃液纤维素酶活性的影响

纤维素在瘤胃内降解主要是通过纤维分解菌分泌的多酶复合体来实现的。瘤胃液中的微晶纤维素酶、羟甲基纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶是分解饲粮碳水化合物的主要酶种［31］。Zebeli等［32］体外研究显示，随着牧草长度的减小，瘤胃内纤维酶活性显著增高。本试验发现大部分时间段微晶纤维素酶、羟甲基纤维素酶、水杨苷酶和木聚糖酶活性随黑麦草长度增大而增大，与以上研究不符，这可能是由以下2方面原因引起的:1)瘤胃液pH，瘤胃液pH对瘤胃发酵有重要的作用，当pH＜6.0时瘤胃中水解纤维素的pH敏感菌会受到抑制［33］。冯仰廉等［34］报道纤维素分解菌对瘤胃液pH的变化敏感，发酵纤维物质的瘤胃微生物在 pH 为6.2～6.8时活性最高，当 pH ＜6.2时其生长繁殖就会受到抑制，使纤维菌分解纤维能力下降，导致反刍动物对粗饲料的消化率降低。本试验中随黑麦草长度增大瘤胃液平均pH显著提高，pH＜6.0的持续时间显著降低，进而瘤胃液纤维素酶活性得到了提高。Zebeli等［32］认为体外研究与体内研究存在差异。24 h内瘤胃液pH随时间剧烈的波动［16］，不同pH变化幅度对酶活影响不同，这导致了本试验中酶活在部分时间差异显著的现象。2)植物细胞壁的结构可能对瘤胃微生物与植物组织的接触具有决定性作用［35］。木质素作为物理屏障，阻止酶穿透细胞壁和近距离作用于细胞内容物［36］。可见，饲料中木质素含量增高，饲料在瘤胃中的发酵性降低。本试验中高ADL/NDF黑麦草显著提高了部分时间段的微晶纤维素酶、水杨苷酶和木聚糖酶的活性，这可能是因为此3种酶对pH较为敏感;含低ADL/NDF黑麦草饲粮在瘤胃中发酵程度较高、瘤胃液pH较低(表6)，酶活受到抑制。

4 结论

①增加黑麦草长度，显著提高饲粮＞8.00 mm层上的 DM 含量及 8.00 mm 层 pef、peNDF，显著降低山羊的DM I及采食时间、显著增加咀嚼和反刍时间。

② 增加黑麦草ADL/NDF、长度均使山羊瘤胃液平均pH提高，pH＜6.0的持续时间显著缩短，部分采食后部分时间点纤维素酶活性提高。

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