微生物酶法测定菜籽粕中硫甙含量

雷 蕾 高雪华 邓小晨

(四川大学生命科学学院,生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都 610064)

我国是世界第二大饲料生产国,其中蛋白质饲料原料主要依靠进口。事实上,我国油菜面积和产量居世界第一,菜籽粕(尤其是双低菜籽粕)是一种优良的植物蛋白质饲料[1],由于其中存在硫代葡萄糖甙(glucosinolate,简称硫苷或硫甙)等致毒物质以及植酸、单宁等抗营养物质,每年有700多万 t菜籽粕资源未得到充分利用[2]。面对蛋白质饲料原料价格不断高涨的形势,菜籽粕的脱毒利用显得尤为重要。

国内外已对菜籽粕脱毒方法进行了大量的研究,其中微生物脱毒法是当前降低菜籽粕毒性最有效的方法。黑曲霉(Aspergillus niger)作为众多菜籽粕脱毒微生物之一,在发酵过程中会产生多种酶,包括植酸酶和芥子酶(myrosinase,EC 3.2.3.1),不但可以较好地降低植酸含量,还能有效降低硫甙含量。

关于菜籽粕脱毒利用方面的研究依赖于硫甙检测技术,研究者已经开发出多种硫甙测定方法,包括重量法、比色法、色谱法等。高效液相色谱法准确度高,但是要测定全硫甙,需要分析菜籽粕中完整的硫甙组成,备齐标品系列,过程繁琐且费用较高[3];氯化钯法色阶较浅、易受干扰;内源酶比色法由于酶源不统一,每次都需确定最佳酶解时间,且不同酶源对测定的稳定性也会有影响[4]。除了直接测定完整硫甙外,其他方法都是通过硫甙的分解产物间接计算出硫甙的含量,这些方法都需要芥子酶的参与。以往国内外的研究表明,已经在一些植物、蚜虫和微生物中检测到芥子酶[5],但目前国内关于芥子酶的研究主要是植物来源,对于微生物来源酶的研究也限于植物芥子酶基因在微生物中的克隆表达[6-7],从降解硫甙的微生物中提取芥子酶却鲜有报道。

本研究首次利用从具有硫甙降解能力的黑曲霉中粗提的芥子酶,通过比色定糖的方法测定菜籽粕中硫甙含量。该方法操作简单、粗酶提取容易,较使用菜籽粕或白芥子的内源酶法测定更为稳定。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基

1.1.1 菌株

黑曲霉 H23为本实验室利用氯化钯法[8]筛选的具有硫甙分解能力的菌株。1.1.2 10%菜籽粕水

称取菜籽粕粉 10 g于 100 m L沸水中浸煮30 m in,冷却至室温后定容至 100 m L,离心,取上清液。5%菜籽粕水制作方法相同。

1.1.3 培养基

10%菜籽粕水、蛋白胨 0.2%、KH2PO40.1%、尿素 0.1%,自然 pH。

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 仪器

752紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂 )、超声破碎仪(日本 Sanyo公司 )、AvantiTM30低温台式高速离心机(美国 BECKMAN公司)、HZQ-C空气振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)。

1.2.2 试剂

白芥子(德仁堂大药房)、丙烯基硫甙标品(Sigma)、3,5-二硝基水杨酸(DNS,分析纯)、氯化钯(成都普思生物科技有限公司)、复合酶液(糖化酶、果胶酶、纤维素酶含量分别 1%、1%、0.5%,成都普思生物科技有限公司)、0.02 mo l/m L Tris-HCl缓冲液 。

1.3 葡萄糖标准曲线绘制

用 DNS定糖法绘制葡萄糖标准曲线[9]。

1.4 粗酶液制备

黑曲霉孢子液 (1.0×106个/m L)按 1%(V/V)的接种量接入培养基中,于 30℃190 r/min振荡培养 60 h,收集菌体并用双蒸水清洗 3次,用0.02 mo l/m L Tris-HCl缓冲液悬浮沉淀,在冰浴中超声破碎 15 m in(超声 5 s,间歇9.9 s),完毕后用缓冲液定容至 15 m L,于 4℃10 000 r/m in离心 10 min,取上清液。

1.5 样品预处理

分别取 1 m L粗酶液至 2支比色管中,将其中1支置于沸水浴中加热10 min,冷却至室温,再在2支比色管中分别加入2μL 100 mg/m L氨苄溶液、100μL复合酶液、1 m L 5%菜籽粕水,置于37℃水浴锅中保温一段时间后蒸馏水定容。

1.6 硫甙测定

用 DNS定糖法测定预处理样品吸光度(A)：A=A(E)-A(E′),式中,A(E)为未加热样品吸光度,A(E′)为加热处理样品吸光度。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

由图 1可得：硫甙(mg/g)=[(0.032 9+A)/13.81]×2.207×稀释倍数,式中,2.207是硫甙葡萄糖转换为硫甙的系数。

图 1 葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard curve of glucose

经过粗酶液处理的菜籽粕,通过 DNS定糖法测得硫甙水解生成的葡萄糖量可由以下计算公式得到：

2.2 方法验证

在 1m L粗酶液中加入 100μL复合酶液,分别处 理 30、40、50、60 μL丙 烯基 硫甙 溶 液(2.99 mg/m L)3.5 h,定容后测定其吸光度,测定结果如表 1所示。

表 1 丙烯基硫甙标准品测定Table 1 Determ ination of allyl glucosinolate standard

粗酶与丙烯基硫甙反应生成了葡萄糖,说明 该粗酶液确含芥子苷酶系。加入不同体积样品后所得吸光度呈现一定梯度,计算值的标准偏差为0.112 mg/m L,对测定结果做 t检验：t(0.05,3)=2.746,t表(0.05,3)=3.182,t(0.05,3)＜t表(0.05,3),表明该方法测定菜籽粕水中硫甙含量可行。表 1中的计算结果比真实含量低,这是因为粗酶中的芥子酶未进行分离纯化。直接进行细胞破碎、离心后得到的粗酶中含有一定的葡萄糖,存在一定的背景。

2.3 干扰因素排除

粗酶液包括黑曲霉所有胞内酶,其中包括淀粉酶、果胶酶、纤维素酶。菜籽粕水中经酶解后能生成还原糖的主要物质有淀粉、果胶、可溶性纤维素和硫甙。因此,通过在所有测试组中都加过量的淀粉酶、果胶酶和纤维素酶来消除其他来源的还原性糖对测定结果的影响。

根据产品使用要求,将淀粉酶、果胶酶、纤维素酶粉分别配制成浓度为 1%、1%、0.5%的酶液以及复合酶液,在各自最适条件下处理菜籽粕水,测定其中干扰底物含量(表 2)。

表 2 干扰底物含量Table 2 Contents of interference substrates

果胶的基本结构是半乳糖醛酸,纤维素的基本结构是纤维二糖。按照淀粉与葡萄糖转换系数的推算方法得到果胶、纤维素与葡萄糖的转换系数分别是 0.978 6、1.901 7,继而通过各自分解产生的葡萄糖量得到相应底物在菜籽粕水中的含量。

根据表 2中淀粉、果胶、纤维素底物的含量,配制含有相应浓度淀粉、果胶、纤维素的混合溶液,取 1m L溶液分别用 1m L粗酶液和 100μL复合酶液在 37℃下水解 6 h。复合酶液分解溶液中物质产生的葡萄糖的量(56.184 mg)大于粗酶液(31.129 mg),表明加入的复合酶活性明显高于粗酶,可以通过在反应体系中加入复合酶的方法来消除样品中淀粉、果胶和可溶性纤维素分解产生的还原糖的影响。

2.4 反应条件选择

将反复洗涤后收集到的菌体分别采用超声破碎和液氮研磨 2种处理方式制取粗酶,菜籽粕水分别取 0.5、1和 2m L,37℃水浴锅中保温 1～8 h后测定试样的吸光度,以选择粗酶制取方式和反应时间(图 2)。

图 2 不同体积样品在不同时间的吸光度Fig.2 Absorbance of sam p les with different vo lum es at different time

从图 2可以看出,葡萄糖量在 1 h内就快速增加 ,随后增长速率相对减缓。加入菜籽粕水为2 m L时,葡萄糖量在5h后基本稳定。当加入菜籽粕水为 1和 0.5m L时,反应在 3 h以后基本平稳。通过超声破碎获得粗酶的反应曲线较液氮研磨方法的平稳,而且超声破碎较液氮研磨操作更为方便、标准,研磨中易出现细胞破碎不均匀和粗酶污染。标准化的操作过程才能保证不同批次酶活的稳定。菜粕水取 1和 0.5m L时的反应曲线都较平稳,但由于本试验所用的移液枪量程为1 m L,取样 1 m L比取样 0.5 m L更能减小系统误差,因此,本试验采用超声破碎获取胞内酶,菜籽粕水取样体积为 1m L,保温时间为 3.5 h。

2.5 稳定性分析

5种取自不同榨油坊的菜籽粕样品,分别用微生物酶法、氯化钯法[10]、内源酶法(以白芥子为酶源)进行多次重复测定,结果的变异系数见表 3。

表 3 不同测定方法样品吸光度的变异系数Table 3 Coefficients o f variation o f sam ple absorbance by differentmethods %

从各种样品多次测定的变异系数来看,微生物酶法测定的稳定性优于氯化钯法,用微生物酶优于用白芥子为酶源时的测定效果,而且不同白芥子之间测定数值的稳定性也存在差异。氯化钯法由于其色阶较浅、易受干扰,所以稳定性不如微生物酶法。虽然作为酶而加入的白芥子量很少,但其硫甙含量高,分别加入各管时的称量误差以及不同白芥子之间硫甙含量的差别是造成其测定稳定性不如微生物酶法以及不同白芥子测定稳定性不同的主要原因。

3 讨 论

黑曲霉是众多菜籽粕脱毒微生物之一,利用它发酵菜籽粕,不但可以较好地降低植酸含量,还能有效降低硫甙含量,这是由于其发酵过程产生的多种酶中包括了植酸酶和芥子酶。本试验从筛选到的 1株具硫甙降解能力的黑曲霉中提取胞内芥子酶,建立了一种利用微生物酶测定菜籽粕中硫甙含量的方法。

作为一种优良的植物蛋白质资源,菜籽粕在脱毒、利用方面的研究依赖于硫甙检测技术。目前存在很多硫甙及其降解产物的测定方法,这些方法都有各自的针对性和优点,可以根据不同需要进行选择,但是它们在某些方面或多或少存在一些不足和缺陷[11]。DNS定糖法成熟、准确性好、稳定性高;微生物酶的使用,解决了内源酶法操作难以标准化的问题,因此,微生物酶法是一种很好的硫甙测定方法。

以往的内源酶法直接以是否加入新鲜的白芥子粉或菜籽粕粉来设计对照,没有考虑酶自身的硫甙以及可能存在的糖化酶、纤维素酶等对测定结果的影响。因此,本方法就背景消除不彻底的问题在对照试验的设计上进行了改进。首先,对照组与试验组所加试剂种类和剂量一致,唯一差别是对照组所加酶液经高温灭活而试验组保存了酶活性,保证了双方的一致性。其次,考虑了其他还原性物质的影响,并通过外加复合酶来消除干扰,使测定结果更准确。最后,也是本方法区别于其他方法最重要的一点,就是使用的芥子酶是运用细胞超声破碎技术从具硫甙降解能力的黑曲霉中提取得到的,解决了其他内源酶法因酶来源不一、操作难以规范化而造成的测定误差和稳定性方面的问题。菌株培养方式和粗酶提取过程的标准化,保证了酶源的稳定和操作过程的标准化,使本方法比原有方法更加稳定,也为其他方法的优化改进提供了参考。

芥子酶催化硫甙葡萄糖苷水解的产物异硫代氰酸盐有抗癌、防止微生物繁殖、降低血压、间接抗氧化作用等功效[12],因此,对微生物来源芥子酶的纯化、性质以及提高产酶量的进一步研究很有意义。

4 结 论

本研究建立了一种微生物酶测定菜籽粕中硫甙含量的方法,其稳定性高于内源酶法,为硫甙测定方法的研究、微生物芥子酶的利用提供了新思路。

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