肠道病毒及其实验室诊断概况

秦剑秋 (广西壮族自治区南宁市疾病预防控制中心,广西南宁530011)

近几年,随着手足口病疫情日益为政府及大众所重视,其病原体肠道病毒 (Enterovirus,EV)也成为广大疾控工作者的工作重点。肠道病毒血清型众多,一种综合征可由不同病毒所引起,同一种(型)病毒可以导致不同综合征,这是肠道病毒属病毒感染的普遍现象。在肠道病毒的实验室诊断方法中,传统的病毒培养与血清中和试验方法是金标准,但具有费时、繁琐,且敏感性不高等局限性,而血清型多样性又限制其血清学检测方法的应用。分子生物学检测技术的发展,为肠道病毒的诊断与分类提供了快速、准确的方法。

1 肠道病毒概况

肠道病毒是小RNA病毒科4属成员中的一大属病毒,人类EV共有70余个血清型。早期根据病毒在人或灵长类动物来源细胞上的复制能力,在不同动物种类上的感染性、致病性和抗原差异性,将人EV分为脊髓灰质炎 (脊灰)病毒 (Poliovirus,PV Ⅰ～ Ⅲ型)、柯萨奇 (Coxsackie)病毒A组和B组(CAV1～22和24型、CBV1～6型)、埃柯病毒 (Echovirus,ECV1～7、9、11～27、29～33型)。鉴于这种分类在一定程度上受到可应用细胞系和自然情况下EV固有生物表现型变异等情况的限制,自1970年起,新鉴定的血清型不再归入以上组别,而以数字编码命名为EV68～71型[1]。随着分子生物学技术与生物信息学方法的应用,新血清型病毒不断被鉴定,至今已报道的新病毒编码到EV111[2-4]。根据生物学及遗传特性将其分为4个组 (species):CAV2、3、5、7、8、10、14、16和EV71组成A组;所有CBV、ECV血清型、CAV9和EV69组成B组;PV 3种血清型,CAV1、11、13、17、18、20、21、24组成C组;EV68、70组成D组[5-7]。也有将PV3种血清型另列为一组,分为5组[8]。

EV因寄居肠道而得名,其共同特点为:病毒呈圆球状颗粒,呈现20面体,立体对称,病毒颗粒裸露,无囊膜。病毒含有一个单股正链RNA分子,大小约7～8kb。主要衣壳蛋白有1A、1B、1C、1D,通常分别称为VP4、VP2、VP3、VP1。肠道病毒可引发多种感染,情况较为复杂。主要包括急性呼吸道疾病、无菌性脑膜炎、脑膜脑炎、心肌炎、手足口病、新生儿多器官衰竭和急性弛缓性麻痹(AFP)[9]等。其发病多以综合征出现,婴幼儿患者可引发严重心肌炎或重症肺炎,而导致死亡。近几年引起大众关注的主要还是肠道病毒所致的手足口病疫情。2008年～2010年7月,中国大陆出现Cox-A16和EV71共循环引起手足口病爆发,部分地区以EV71为绝对优势型别,少数以CoxA16为优势型别[10]。肠道病毒感染临床表现多样化,一种综合征可由不同病毒单独或共同引起,同一种 (型)病毒可以导致不同综合征,这是肠道病毒属病毒感染的普遍现象。而某种症状也常由多种血清型的肠道病毒引起,如小儿麻痹症就是脊髓灰质炎病毒与肠道病毒其他血清型共同作用的结果[11-12]。因而从公共卫生的角度,对病原体进行实验室诊断十分必要。只有对病原体进行实验室诊断,才能在一次疾病的爆发或流行中确定各病例间的流行病学关联,进而确定EV特异血清型的病原谱。

2 肠道病毒诊断方法

2.1 病毒分离与血清中和试验

利用组织培养技术从感染部位或传染源分离出病毒并鉴定其特异性血清型是病毒性疾病诊断的金标准。病人粪便标本是最常采集的标本,其他如咽拭子、脑膜炎患者的脑脊液、心包炎患者的心包积液、手足口病患者的疱内渗出液、结膜炎患者的眼部分泌物等都是常用分离病原的标本。EV常用接种细胞系有:猴肾细胞系 (I I C-MK2)、人肺细胞系 (MRC-5)、人横纹肌肉瘤系 (RD)、非洲绿猴肾细胞系(Vero)和人肺癌细胞系 (A549)等[13]。

病毒接种后经过培养,可以利用电子显微镜进行观察鉴定。一般来说,肠道病毒型特异性鉴定主要靠血清中和试验。在病毒分离基础上,应用组合血清和/或型特异性血清进行中和试验来定型分类。因在实践中不可能用70多个型特异性抗血清进行逐一中和,所以发展了超免疫组合血清进行初步定型,再用特异单型抗血清证实。目前常用的Lim Benyesh Melnick(LBM)组合血清 (A～H)可鉴别42个型EV[14](包括ECV22、23)。如果未鉴定成功,可再用另外含19个型CAV抗体组合 (J～P)进行鉴定[15]。另一种组合血清是目前世界卫生组织 (WHO)推荐脊灰实验室应用的RIVM组合血清,它还可对EV68～71型进行鉴定[16]。但中和时常遇到无法定型的病毒株,主要原因有[17]:①2种及以上型别混合感染。由于EV不同型别的混合感染发生率较高,可在定型前通过对分离物进行空斑形成试验或3′系列终末稀释传代进行纯化;②组合血清未包含所有血清型,如运用LBM组合血清,CAV3、11、15、17、24和EV68～71型就无法鉴定;③EV有时会聚集在一起,必须通过脱氧胆酸钠或氯仿或超滤处理,使其分散后才能进行鉴定;④可能由于抗原变异与标准株抗血清不产生中和反应;⑤确实是新型别无法定型。

病毒培养对缩短抗生素治疗和住院期有积极作用,其定型诊断对流行病分析有重要意义。但是,病毒的分离鉴定繁琐、费力、耗时,一般需要1周甚至更长的时间才能观察到细胞病理反应 (CPE),不能满足疫情处置对时间的要求。而根据细胞病理反应无法确定病毒的类型,同时费用高、敏感性低,检测结果受主观因素干扰较大,并需要较高的专业知识及实验室设备。更重要的是许多肠道病毒不能进行细胞培养,或者可以培养但不出现细胞病理效应,如柯萨奇A组病毒,往往贻误特异性治疗。同时对诊断某些肠道病毒血清型和脑膜炎的敏感性也欠佳,给临床诊断和快速检测工作带来困难和挑战[18]。

2.2 血清学检测

人体感染肠道病毒后,可产生3种特异性抗体:IgA,由唾液及肠道局部产生;血清中受染后1～3d可出现IgM,提示为新近感染,中和抗体可维持数周;IgG主要为IgG1和IgG2 2个亚型,具有较持久性特异性免疫力,提示为既往感染。血清学试验主要是酶联免疫吸附试验 (ELISA)、中和试验、血凝抑制试验、补体结合试验、免疫荧光试验等方法检测这些抗体。利用酶联免疫吸附试验捕捉法或间接法检测早期病人血清中的IgM和IgG抗体,是较常用的检测指标,尤其以柯萨奇B组病毒的感染诊断较多。另外,病毒抗原还可从心、脑、脾、胰、肝和胸腺等多器官检出。在暴发疫情的肠道病毒血清学鉴定中,一般单份血清IgM抗体效价无意义,因为健康人血清中IgM抗体都有一定效价,易造成误判;双份血清检测IgG抗体,恢复期抗体效价呈4倍以上升高,才具诊断意义。由于,第二份血清采集时间比第一份至少延后1～2周时间,得到明确诊断需至少1周以上时间。因此该方法在检测中不适用于暴发疫情的早期诊断,可作为回顾性调查手段之一;同时因肠道病毒血清型别众多,临床使用检测价值有限,而多为流行病学采用[18]。

2.3 分子生物学方法

随着分子生物学技术的发展,EV诊断鉴定方法已从血清学分析转向遗传学分析。基于RT-PCR方法的EV诊断技术是目前灵敏度最高的RNA检测技术[19],它以RNA为模板逆转录成互补DNA(cDNA)的第一条链,再以该链为模板进行PCR反应,由此可以检测出单个细胞中少于10个拷贝的特异的RNA。RT-PCR技术克服了传统方法检测灵敏度低、操作繁琐的缺点,PCR检测一般可在收到标本后2～5h内提供诊断结果,是目前较理想的诊断技术[20-22],已在医学和生物学领域内得到了广泛应用。

早期大多数研究都采用针对5'NCR的RT-PCR,然后进行核苷酸测序。虽然不能用于分型鉴定,但由于5'NCR编码HEV基因组的一段保守序列,比较易于设计引物,可以用于EV的RT-PCR初步筛查。根据VP1全序列对EV的遗传学分类与第7次国际病毒分类委员会 (ICTV)通过的分类结果完全一致,但应用RT-PCR和测序技术测定VP1部分序列对EV进行分型鉴定仅能鉴定42个原型株。这可能是因为各血清型中引物序列的高度多样性所致的引物特异性低造成的。对不能定型的EV至少要用5套简并引物扩增VP1全序列,而且少数分离株也难以扩增。Caro等[23]又在VP1和2C设计了一套引物扩增所有HEV的原型株,但仍不能扩增CAV5、19、22型等在乳鼠增殖的原型株,以及EV68型和EV70型原型株。在将EV分成亚组方面VP4序列定型方法不如VP1序列敏感,但VP4序列定型法中使用的引物能扩增所有的EV原型株,而且引物序列比较保守,能扩增30a间在不同地区收集的26个血清型的89株EV。随着分子生物学技术的发展,Hiroaki等[24]建立了应用HEV衣壳蛋白VP4的207个核苷酸序列的种系发生树进行分子诊断的方法。

新近发展的RT-PCR技术,利用PCR对DNA的高效扩增,探针技术的高特异性和光谱技术的高灵敏性的特点,不仅克服了常规PCR检测的不足,并且具有直观、重复性好、灵敏性高和易操作等特点[25],逐渐应用于常规肠道病毒的实验室诊断。由于近年手足口病疫情的进一步发展,国内多家实验室都自行研发了用于手足口病实验室诊断的EV71及CoxA16的引物探针,使得这一技术在疫情的处置上充分发挥了作用。

在PCR作为诊断技术主流的同时,建立在核酸基础上的新一代诊断技术正在形成,如检测遗传物质的环介导扩增技术 (LAMP)和基因芯片技术。环介导扩增技术 (LAMP)是一项比PCR更具活力的方法,它需要便宜简单的仪器,在野外就可以使用这种方法。基于该特点,国内已有人建立了适于肠道病毒现场或临床检测的快速方法[26]。核酸芯片技术用单一操作可以检测数百种或数千种病原/菌株,具有高通量、灵敏度高、特异性强和检测时间短等优点,因此特别适合用于肠道病毒的实验室诊断。目前,我国崔伦标等[27]建立的液相芯片检测方法正是基于该技术并成功应用于手足口病的病原检测。

3 结语

肠道病毒作为一种古老的病毒已经与人类共同存在了数千年,随着脊髓灰质炎被消灭后,这一属病毒中最引人注目的当是引起手足口病的柯萨奇病毒及新肠道病毒 (以71型为主)。由于这些病毒的易变性,目前尚无疫苗可防。而这些年来手足口病疫情势头不减,给防控工作带来了难度。为此,快速准确的分子生物学检测实验室诊断技术是应对突发的手足口病疫情的有效的技术手段。针对其血清型别众多的特点,基于基因芯片技术的高通量的检测将是肠道病毒分子生物学检测技术今后发展的主要方向。

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