我国狗牙根种质资源研究进展

齐晓芳，张新全，凌 瑶，刘 伟，彭 燕

(四川农业大学草业科学系，四川 雅安 625014)

狗牙根(Cynodondactylon)是暖季型草坪草中生长和建坪最快的草种。其生命力强，繁殖迅速，成片生长，耐践踏，籽播或草茎繁殖均可，以无性繁殖为主，播种量10～15 g/m2。许多科研工作者从形态学、细胞遗传学、数量遗传学、系统分类学及分子生物学等角度对狗牙根展开了广泛研究，为其育种、遗传图谱的构建及进一步研究奠定了良好基础。目前，狗牙根在我国已被广泛种植和应用，在生态环境建设和畜牧业发展中均发挥着巨大作用。

1 狗牙根的分布及用途

一般认为，狗牙根起源于非洲，欧亚大陆、印尼、马来西亚,印度也是其分布中心。其广泛分布于东西半球热带、亚热带甚至温带地区[1-7]。在我国，狗牙根主要分布于黄河流域及其以南地区，此外新疆、吉林、青海、甘肃、河北等地均有分布[8]。由于其耐修剪、耐践踏、质地细腻、色泽好且密度均一，在庭院草坪、城市绿化、运动场草坪的建植中被广泛应用，但生长迅速的特点又导致其在生长期极易形成枯草层，需频繁修剪，留茬高度一般为3～4 cm。由于其耐粗放管理、根系发达，也是一种优良的固土护坡植物，在公路、铁路、水库等的固土护坡中被广泛应用。由于叶量丰富，草质柔软，味淡，适口性好，众多家畜均喜食，狗牙根也是一种优良的牧草[9-10]。

2 我国狗牙根的遗传多样性研究进展

遗传多样性是一个物种对人为干扰进行成功反应的决定性因素，种内的遗传变异程度也决定其进化的潜势[11]。对遗传多样性的测度主要依靠遗传标记来完成。目前常用的遗传标记有4种类型：形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记，前3种都是基因表达型的标记，第4种标记直接以种质资源的遗传物质为研究对象，是基因型的标记。

2.1形态学研究进展 形态学标记指植物生长发育过程中，肉眼能观察到的形态特征，如株高、叶形、穗长等，是个体基因型的外在表现。对处于不同生境下同种材料的形态学研究，可以了解环境对基因表达的影响。从形态学或表型性状检测遗传变异是最直接也是最简便的方法。种质资源分类、鉴定及育种材料的选择通常都是依据表型性状进行。

我国野生狗牙根形态变异很大，并随生境的不同而呈现出一定的规律。郑玉红等[12]对50份狗牙根种源的根状茎深度、密度和直径进行田间观测，发现我国狗牙根根状茎深度、密度和直径随纬度的增加而呈现出明显的地带性变异特征，而且三者随纬度的增加而显著加深、加密和加粗。刘建秀等[13]对444份狗牙根种源的外部形状进行观测分析，发现我国狗牙根不同种源外部形状具有广泛的变异，其中在高度(草层高度、生殖枝高度)、营养器官长度(叶片长度、节间长度)以及株型(短茎形态、形态指数)等方面的变异最大，其次为均一性、密度和叶色等，而在穗部形状(穗长、小穗长度和穗枝数)方面变异最小。张小艾和张新全[14]对20个西南区野生狗牙根综合形态指标的观测中发现，在同一形态指标中，材料间差异显著，变异系数范围为10.11%～131.53%，说明不同生境的狗牙根在遗传上存在着丰富的多样性。四川农业大学草业科学系在前人研究结果的基础上对我国西南区大量的野生狗牙根资源进行了细致的研究观察，为以后的新品种选育奠定了坚实的基础。刘伟[15]应用景观-性能-应用适合度的综合评价体系对西南区野生狗牙根资源进行了评价，筛选出10余份优异种质，其草坪评分较美国品种Tifway高。来自四川汶川的材料具有株丛低矮和缓慢生长的特性；另外采自四川阿坝、西藏林芝地区海拔2 500～3 080 m的材料表现出较强的抗寒性、草坪绿期长；采自横断山区干热(旱)河谷、四川自贡的材料表现出相当的抗旱性，这些性状都应在以后的育种工作中进一步加大开发利用。易杨杰[16]对我国西南区的32份狗牙根种质资源的10个植物学特征进行统计分析，发现不同材料间植物学表型特征存在广泛的变异。聚类分析将供试材料分为5类，表型特征相似的材料首先聚为一类，聚类结果与材料地理来源部分一致。初秀娟[17]以“南京狗牙根”和“Tifway”为对照，对5份由四川农业大学经过多年反复观测筛选得出的性状优良的野生狗牙根进行区域适应性研究，对材料的10个表型性状进行观察统计，从5份新品系和2份对照品种的质地、色泽、密度、抗逆性、成坪速度和绿色期等方面综合分析，选出Sau9926为综合表现最佳的品种。

2.2细胞学研究进展 细胞学标记是一种利用染色体数目、核型、分带带型、减数分裂的行为等进行植物分类的方法，这种方法被广泛用于种质资源的鉴定中[18]。细胞学标记主要包括核型、染色体带型、原位杂交及染色体的非整倍性和结构变异等，能准确反映植物体内出现的细胞水平多样性。

在狗牙根种质资源细胞学研究方面，目前主要是通过对狗牙根染色体数目的分析来确定未知染色体组物种的染色体组组成及种源关系。据Hanna等[19]报道，引自上海地区狗牙根中选育出的品种“Tifton10”染色体数目为54条。普通狗牙根的染色体倍性同土壤的酸碱性有关，当土壤pH值<5.0时，出现完全的二倍体种群；pH值>6.5时，出现完全的四倍体种群；当pH值为5.0～6.0时，二倍体和四倍体植株混合生长[20]。Wu等[21]对130份狗牙根材料进行了核型分析，结果表明，供试材料存在多种染色体倍性水平和非整倍体，且以六倍体居多(89%)，狗牙根染色体倍性变异大，且与地理位置存在一定相关性。郭海林等[22]对我国有代表性的30份狗牙根材料染色体数目观测发现，4n(32.20%)>5n(18.90%)>3n(10.50%)>6n(2.13%)>2n(0.41%)，且非整数倍比率高达32.10%；染色体数目与种源分布的纬度、经度以及海拔均无显著的回归关系，说明我国狗牙根种质资源染色体数目有极丰富的变异性，不同种源具有不同染色体数，同一种源不同根尖存在不同倍性，甚至同一根尖的不同细胞具有不同倍性。一些表现优良的多倍体、单倍体可直接用于生产和育种。龚志云等[23]对三倍体狗牙根“矮生百慕大”进行细胞学研究，结果表明，其细胞内染色体数存在非整倍性变异，变化范围为27～30。进一步利用荧光原位杂交(FISH)技术以45SrDNA为探针进行鉴定，发现在三倍体狗牙根“矮生百慕大”细胞中有3条染色体含有45SrDNA，并且都位于着丝粒部位，这3条染色体上的杂交信号强弱不一，2个染色体在45SrDNA区杂交信号较强，且易伸长呈线状结构，可能由于杂交信号较弱的一条染色体45SrDNA含量比较少，所以这一区域染色体很易在分裂中“拉长”并断裂形成非整倍体。马克群等[24]观测分析了10个普通狗牙根和3个非洲狗牙根优质选系的染色体数目，发现非洲狗牙根主要是2n=18，存在少部分的染色体数目变异，狗牙根染色体倍性变异大，供试的选系存在多种染色体倍性水平和非整倍体；染色体数目绝大多数都为18～36，并以整倍体为主；根据染色体的数目，将供试选系分为5类。

狗牙根染色体大范围的变异说明其遗传的多样性，对育种工作相当有利，是培育品质优良、适应多种生境的新品种的基础；但另一方面，狗牙根大范围的染色体倍性变异，给通过染色体的检测来鉴定杂交后代带来困难，这方面尚需深入研究。

2.3生化水平研究进展 生化标记主要是同工酶、等位酶和种子贮藏蛋白，它们是基因表达的直接产物(蛋白质)，其结构多样性能从一定程度上反映生物遗传物质组成上的差异和生物体遗传的多样性。国外在研究狗牙根遗传多样性及品种鉴定时，在蛋白质水平上开展了较多的工作。在国内，郑玉红等[25]对我国有代表性的15份狗牙根无性系叶片的过氧化物(POD)同工酶、超氧化物歧化酶(SOD)同工酶和酯酶(EST)同工酶进行聚丙烯酰胺不连续垂直平板电泳试验，结果表明，各同工酶的谱带数、相对迁移率不尽相同，呈现出较丰富的多样性；酶谱的聚类分析结果与种源的地理分布格局相吻合，而各酶谱带数与该种源所在的经纬度无显著关系。王赞[26]、张小艾[27]采用EST和POD同工酶对西南地区野生狗牙根遗传多样性进行检测，发现狗牙根EST的多样性程度高，作为遗传标记，适合狗牙根种以下亲缘关系和遗传多样性的研究。

2.4分子水平研究进展 DNA的多态性是生物多样性的本质内容。为了深入掌握生物多样性的遗传学基础，最理想的办法就是直接观察DNA的变异。分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。依据对DNA多态性的检测手段，DNA标记可分为四大类[28-35]。(1)基于DNA-DNA杂交(Southern杂交)的DNA标记，如RFLP标记。(2)基于PCR的DNA标记，根据所用引物的特点可分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记。随机引物PCR标记如RAPD标记、ISSR标记等，特异引物PCR标记如SSR标记、STS标记等。(3)基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记，这类DNA标记也可分为2种类型，一种是通过对限制性酶切片段的选择性PCR扩增来显示限制性片段长度的多态性，如AFLP标记；另一种是通过对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示被扩增区段的多态性，如CAPS标记(PCR-RFLP)。(4)基于单核苷酸多态性的DNA标记，如SNP标记，目前一般通过DNA芯片技术进行分析。

梁慧敏[36]对我国部分野生狗牙根和栽培品种的RAPD分析表明，20个引物在28份材料之间均具有多态性，其RAPD扩增的总多态位点百分率达96.34%。谢永丽等[37]根据狗牙根近缘植物的DREB转录因子的AP2/EREBP保守结构域的基因序列，通过RT-PCR和RACE的方法分别从冷诱导和盐诱导的狗牙根cDNA中扩增到了2个似DREB基因，分别命名为BeDREB1和BeDREB2，其中BeDREB1基因受冷胁迫的诱导表达，而BeDREB2受盐胁迫的诱导表达，且随着诱导时间的不同，表达量也在发生变化。上述结果表明，从狗牙根中克隆到的BeDREB1和BeDREB2基因属于DREB转录因子家族的新成员，在狗牙根中分别与冷胁迫和盐胁迫的信号转导有关。刘伟等[38]用3种分子标记RAPD、ISSR和RAMP揭示的我国西南区野生狗牙根遗传相似系数(GS)分别为0.52～0.86、0.73～0.96和0.61～0.97，说明我国西南区野生狗牙根有较大的遗传多样性。从聚类划分看出类群同地理分布也有一定关系[15,38]。易扬杰等[39]采用SRAP分子标记技术对采自四川、重庆、贵州、西藏4省区的32份野生狗牙根材料进行遗传多样性分析，多态性位点百分率为79.8%，平均GS值为0.759，遗传多样性同样丰富。四川农业大学草业科学系采用AFLP标记技术对采自非洲以及中国西南五省区的44份野生狗牙根材料进行遗传多样性分析。10对引物共扩增出462个条带，多态性比率97.64%，材料间的GS值范围为0.64～0.95。聚类分析将供试材料分成五大类，分类结果与材料的地理分布大致相符，呈现出一定的地域性分布规律。该研究对制定科学的狗牙根资源保护策略、促进其开发利用以及新品种的选育都具有重要的意义[40]。

3 我国狗牙根育种进展

3.1狗牙根的育种目标 狗牙根基本的育种目标主要包括高观赏性、强抗逆性及较长的持久性[41]。观赏价值主要指草坪色泽、密度、质地、均一性及绿坪期性状；抗逆性主要包括抗寒性、抗旱性、抗病性、抗虫性、耐盐碱性、耐荫性、耐热性以及抗除草剂性能等性状；持久性是指草坪的耐践踏性、成坪速度快慢、绿期长短以及草坪的使用年限等。

3.2狗牙根的育种途径及技术 目前，狗牙根的育种途径主要有系统育种、杂交育种、诱变育种和高新技术育种等方法。系统育种即采用优良单株进行系统的培育新品种；杂交育种是现代草坪育种的重要途径，狗牙根的种子繁殖品种绝大多数是通过杂交育种而成的；诱变育种具有突变率高、改变单基因控制性状简便以及诱发的变异较为稳定等特点，也是狗牙根育种的重要途径之一；高新技术育种主要表现在生物技术的应用上。生物技术在草坪植物新品种选育中的应用已经达到细胞及分子育种水平，主要包含细胞融合、基因导入及细胞选择等方面[42-45]。狗牙根的高新技术育种成果目前未见报道。

3.3狗牙根的育种现状 我国是狗牙根种质资源最丰富的地区之一，但是狗牙根的育种工作开展较迟，直到20世纪50-60年代随着杂交狗牙根新品种的引入，其育种工作才正式开始，并主要在长江流域及以南地区得到较大发展。以下是我国近几年育成的新品种：1994年，甘肃草原生态所张巨明等通过引进驯化的方式成功育成并申报了狗牙根品种“兰引1号”；2001年，江苏中科院植物所刘建秀等通过驯化，培育成了“南京狗牙根”；2001年，新疆农业大学阿不来提等育成狗牙根品种“新农1号”，并在同年通过野生栽培驯化成另一新品种“喀什狗牙根”；2005年，阿不来提等又育成了“新农2号狗牙根”；2007年，四川农业大学张新全等通过野生栽培选育出了绿期明显较长的新品种“川南狗牙根”，该品种适宜在我国西南及长江中下游等地区生长；2008年，河北农业大学通过野生栽培选育出2个品种“邯郸狗牙根”和“保定狗牙根”，这两个品种在河北省保定、沧州以南的冀中南平原及河南、山东平原地区及类似地区适宜栽种。

4 问题及展望

狗牙根作为我国草坪草中最重要的草种之一，目前广泛应用仍是引进的草种，这些草种抗逆性较差、适应范围较窄，已远远不能满足我国草坪业快速发展的需要。总体来看，我国的狗牙根种质资源评价与改良工作水平高低，限制了资源的充分利用,尤其在杂交、诱变和高新技术育种方面的工作开展更少，严重制约了国产狗牙根新品种的培育。

我国有着丰富的野生狗牙根资源，种质变异大，资源收集与品种选育工作才刚起步不久，需要继续进行以下几方面的工作。(1)资源收集方面。进一步充分、系统收集我国野生狗牙根资源，加强对其开发利用，并做好种质资源的保存、鉴定工作，逐步建立系统规范的种质资源收集、整理及评价体系。狗牙根的收集可参照纬度带分布结合生境类型进行，保存时尽量避免生物学混杂，国外应用的牧草离体保存方法值得借鉴。(2)遗传多样性方面。在研究狗牙根种质变异及遗传多样性时，除了应用传统的形态学表型识别和以染色体结构与数目为特征的细胞学标记识别外，应用具有组织、发育和物种特异性的同工酶识别以及分子标记和基因克隆，特别是DNA分子标记识别，能检测出更加丰富的遗传多样性，可清楚地了解材料间的亲缘关系，并为特定性状进行基因定位。(3)育种方面。开展野生狗牙根生态型的驯化选择，并利用野生狗牙根进行栽培品种的改良；在此基础上结合生物工程手段，对优良性状基因定位，摸索建立狗牙根基因转化体系。充分利用本土丰富的狗牙根种质资源，积极引进国外资源，开展杂交育种。利用体细胞选择和转基因等高新育种技术，培育出优质的国产狗牙根新品种，以满足市场的不断需求。

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