受体型酪氨酸激酶RON在乳腺癌侵袭及转移中的作用研究进展

莫光泉，张宏颖 综述,李连宏 审校

(大连医科大学 病理学与法医学教研室, 辽宁 大连 116044)

乳腺癌(breast cancer)发生率为28%，位于女性肿瘤的首位；死亡率为15%，仅次于肺癌，位列第二，为最常见于女性的致命性肿瘤之一，易复发和转移[1]。因而，阐明乳腺癌转移的细胞和分子机制有望为乳腺癌治疗提供更好的方法。RON(The recepteur d'origine nantais)蛋白是受体型酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinases，RTK)大家族中c-Met子家族的一员，其生物学效应主要是通过与它的配体——巨噬细胞刺激蛋白(macrophage stimulating protein，MSP)结合而活化，通过许多细胞内信号级联反应，导致细胞增殖、移动和基质侵袭。RON在包括乳腺癌在内的许多人类肿瘤中过表达，并且有临床研究表明RON过表达与肿瘤病人预后不良和转移都有关系。在转基因小鼠上诱导RON过表达会导致肺和乳腺的肿瘤形成，并与肿瘤转移播散有关[2]。这些都提示RON与人体乳腺癌形成和播散有关。本文重点综述RON在乳腺癌侵袭及转移中作用的研究进展。

1 原癌基因RON蛋白的生物学特征

编码RON蛋白的cDNA最初是在1993年从人的皮肤角化细胞中克隆而来。RON基因由20个外显子和19个内含子组成，定位于人类染色体3p21。成熟的RON蛋白是由α/β两个蛋白亚单位组成的单体，相对分子质量约为185 kD。α-亚单位的相对分子质量约40 kD，完全位于细胞膜外。β-亚单位的相对分子质量约为145 kD，由胞外区、跨膜片段和胞内激酶区三部分组成，与α-亚单位间通过二硫键相连。胞外区含有各种活性结构，如N-末端信号(semaphoring，SEMA)功能域、1个丛蛋白-信号-整合素(plexin-semaphor-integrin，PSI)构型区和4个免疫球蛋白-丛蛋白-转录(immunoglobulin-plexin-transcription，IPT)结构域。胞内区含有多个重要的酪氨酸残基，后者的磷酸化反应是RON生物学功能的基础。C-末端有多个信息分子锚定位点，是RON与下游信息分子接触、传递信息的重要结构点。MSP为目前唯一所知的RON的特异性配体，又称为肝细胞生长因子样蛋白(hepatocyte growth factor-like protein，HGFL)。HGFL的无活力前体主要由肝细胞合成和分泌[3]，在病理状况下，HGFL经酶水解作用后，在细胞表面形成成熟的双链蛋白，其β链以“酶-底物”模式结合于RON并诱导其生物学活性。

RON主要表达于人体各种上皮细胞，如结肠和乳腺上皮细胞。许多不同类型的终末分化巨噬细胞亦有RON表达[4]，在肺泡、甲状腺、心脏、平滑肌、成纤维细胞和内皮细胞几乎没有RON的表达[5]。在进化上，RON对正常的胚胎发生是必需的。完全敲除RON基因会引起小鼠胚胎在早期阶段死亡。有研究表明Sp-1位点是RON启动子保持活性所必须的，Sp-1依赖的RON酪氨酸激酶表达和乳腺癌细胞侵袭之间有明显联系[6]。

RON的激活方式有两种，即MSP依赖性和MSP非依赖性途径。RON的SEMA域与MSP的β链结合而引起RON受体分子同源二聚化，从而诱导其磷酸化和激酶的激活。RON也能在没有配体MSP存在下传导信号，细胞粘附于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，如Ⅳ型胶原，通过整合素的介导，RON通过发生自身磷酸化而激活。但是，RON介导的细胞增殖和移动都需要MSP的参与。单独MSP或RON mRNA过表达不会和患者疾病状况有显著联系，表明RON在乳腺癌转移中的功能很可能是配体依赖性的[7]。MSP的激活能增强巨噬细胞的趋化性，MSP刺激RON导致细胞形状和活动力改变[8]。通过RON进行的MSP依赖性和MSP非依赖性信号传导在某种程度上可以通过Src家族的激酶介导。以上表明，RON有两种可选的信号传导模式来促进正常乳腺上皮细胞癌变[9]。RON激活后向胞内转导级联信号，促进细胞生存、增强细胞播散和移动。RON受体激活导致受体酪氨酸激酶下游区信号传导通路激活，而在肿瘤模型中最突出的信号途径是Ras/有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/Akt和β-连环蛋白的激活。其他信号途径还包括jun N-末端激酶(JNK)/应激激活蛋白激酶、局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)、c-Src、Smad和核因子-κB(NF-κB)分子等[10]。

2 RON在乳腺癌侵袭及转移中的作用

肿瘤侵袭与转移过程至少涉及到以下几方面的调控因素：1)粘附分子参与肿瘤细胞间的分离以及肿瘤细胞与胞外基质的粘附；2)肿瘤细胞或间质细胞分泌的蛋白水解酶及其抑制剂在降解胞外基质和血管的基底膜过程中发挥重要作用；3)在基底膜缺损区域肿瘤细胞以自身的阿米巴运动方式发生移动和侵袭，在血管或淋巴管内启动血小板聚集，形成肿瘤细胞栓子，迁移到淋巴结或转移靶器官；4)新生血管形成，伴随着肿瘤细胞的增生，形成新的转移灶，完成转移过程。RON可能通过干预上述步骤参与乳腺癌的侵袭与转移过程。

2.1 RON在乳腺癌中的异常表达

在乳腺组织中，RON在正常乳腺上皮细胞和良性乳腺损伤(腺瘤和乳头状瘤)中相对低表达，而在近50%各种组织分型的原发乳腺癌中异常高表达，并与疾病的发展阶段和绝经后状态有关联。但RON突变与乳腺癌没有关联，表明野生型RON蛋白的过表达足以促成肿瘤的生长和进展[3]。在乳腺上皮中过表达野生型RON或组成性激活RON受体的转基因小鼠中，乳腺组织RON表达显著提高，经过12周出现增生表型。RON过表达程度足以诱发乳腺细胞转化，并伴有高度转移，在超过86%转基因小鼠的肝、肺中发现转移灶，并且发现RON过表达导致了受体磷酸化，并伴有酪氨酸磷酸化的β-连环蛋白水平升高和与人类乳腺癌不良预后有关的细胞周期素D1和c-myc基因上调[11]。RON过表达的原因现在还未知。MSP和RON所在的3p21基因区在癌症中经常改变，这个基因区在包括乳腺癌在内的多种肿瘤和癌症细胞系中发生基因扩增[3]，表明基因扩增可能会促进MSP或RON在乳腺癌中的过表达。和上述结论一致的是MSP也在高达20%的早期人类乳腺肿瘤中过表达[12]。在体外生长的乳腺癌细胞中，RON过表达导致癌细胞的增殖、迁移和通过基底膜的侵袭能力增强，并抑制细胞凋亡和失巢凋亡(指细胞通过与基底膜或ECM的分离而发生凋亡的过程)。这表明RON表达增加与磷酸化状态和侵袭活性强烈相关，提示RON异常表达在人类乳腺癌向侵袭-转移演进中起作用。而且，RON过表达是乳腺癌远处再发的一个独立指标；在无淋巴结转移的乳腺癌患者中RON和c-MET共表达者10年生存率仅为11.8%，远低于RON-/c-MET-者(79.3%)，这表明RON和c-MET协同表达可能促进乳腺癌的进展[13]。有研究表明细胞周期检验点激酶2(cell cycle checkpoint kinase 2，CHEK2)(对于小鼠是Chk2)的多态变异体，Chk2*1100delC，导致基因组不稳定，并与乳腺癌危险性增高有关，在Chk2*1100delC作用基础上的RON过表达使乳腺肿瘤进展加快，受体酪氨酸激酶和一个细胞周期的调节物Cdc25A介导的信号通路能加快体内肿瘤发生[14]。

2.2 RON促进乳腺癌侵袭与转移的可能机制

2.2.1 RON变异体与乳腺癌

癌症细胞中RON表达变化常常伴随通过选择性前-mRNA剪接、蛋白平截或选择性转录而导致RON变异体生成[15]，这是RON蛋白呈现多样性的原因。目前已经在各种原发癌样本和已建的肿瘤细胞系中鉴定出9种RON变异体，根据其分子量分别命名为RON△170、RON△165、RON△165.e11p、RON△160、RONE5/6in、RON△155、RON△p110、RON△85和RON△55[15-17,18]。

RON△165，RON△160和RON△155以野生型相对高频率地表达于乳腺癌等肿瘤中。RON△165是由RON β链的胞外区第四个IPT结构域框内缺失外显子11编码的49个氨基酸而形成的。这一缺失阻碍了蛋白溶解过程，导致单链原-RON△165在胞浆里积蓄。RON△165能够组成性磷酸化，虽然不具有细胞转化活性，但是在转化细胞中能诱导能动的侵袭性表型形成。RON△165.e11p是由外显子11缺失了前40个氨基酸后产生的，与RON△165的不同在于第四个IPT功能区上的9个固定的氨基酸，与RON△165均为存在于细胞质中的单链蛋白，均无法发育成熟为双链受体，均能在体内自发地形成低聚体，导致结构上的磷酸化和下游信号蛋白如Erk1/2的激活。尽管缺乏细胞转化活性，RON△165和RON△165.e11p介导上皮细胞向间充质细胞的过渡，即上皮-间质转换(epithelial to mesenchymal transition，EMT)。此外，RON△165或RON△165.e11p在乳腺癌MCF-7细胞中的表达能减少上皮细胞表型，增加自动侵袭活性[16]。

RON△160和RONE5/6in可见于乳腺癌Du4475细胞系中，是RON β链胞外区第一个IPT单位内分别发生缺失和插入形成的，都经蛋白水解作用形成双链受体并表达在细胞膜上。RON△160是外显子5和6编码的109个氨基酸结构内缺失而形成的，这个缺失引起RON结构改变，通过酪氨酸残基磷酸化而组成性激活，对于胰蛋白酶样酶有抵抗作用，并能耐受抗-RON抗体介导的受体内在化，因而有助于维持细胞内信号级联，促进在体外的细胞转化和在体内的肿瘤生长[15]。而RONE5/6in是RON β链胞外区第一个IPT单位外显子5和6编码产物间插入了20个氨基酸而形成的，其活化需要配体刺激，易经蛋白酶形成RON△p110这种平截变异体，并且是RON△p110形成的主要来源。RONE5/6in在抗-RON抗体治疗时迅速内在化，导致下游信号减弱。尽管配体介导的RONE5/6in激活可以引起EMT，却是RON△160在细胞灶形成和非依赖性贴壁生长中表现出细胞转化活性[17]。RON△160介导的EMT也与细胞移动/侵袭能力增强有关。RON△p110是在RON β链胞外区上的Arg631-Lys632残基处由于蛋白水解作用平截产生的，失去了全部SEMA区和PSI结构域和部分第一个IPT结构域。RON△p110组成性活化，出现在过表达RON的肿瘤细胞膜上[15]。RON△p110在细胞转化和肿瘤形成中的作用目前尚在研究中。

RON△155是RON β链的胞外结构域框内缺失由外显子5、6和11编码的158个氨基酸而形成的。尽管以未加工的单链形式被保留在细胞浆里[15]，RON△155组成性激活并具有与RON△160类似的细胞转化和致肿瘤活性。

RON△55也称作短型RON，是由RON基因的外显子11编码的Met913替代激活产生的，和RON基因启动子远端区域的超甲基化有关[19]。在人乳腺癌细胞中，RON△55能调节E-钙粘蛋白表达，从而引起肿瘤演进。RON△55没有细胞转化活性，但能增强细胞生长和迁移[15]。

RON△170和RON△85这两种变异体具有针对RON和上述变异体的拮抗活性。RON△170是由激酶结构域外显子19编码的46个氨基酸缺失而形成的，导致阅读框漂移，在nt3998产生一个终止密码子，具有显性的阴性抑制剂作用，在结肠癌细胞中能抑制有致癌性的变异体RON△160介导的肿瘤形成活性[20]。RON△85是由乳腺癌细胞系RON基因的外显子5和6之间插入49个核苷酸得到的mRNA转录产物产生的，也造成阅读框漂移，产生终止密码子，造成细胞外β链不完整。RON△85与MSP直接结合，形成MSP-RON△85复合体，并抑制RON磷酸化。RON△85还干扰RON、RON△160的二聚化过程，阻碍它们磷酸化，并减弱下游信号。在结肠癌和胰腺癌细胞中，RON△85抑制自发的或MSP介导的Erk1/2和AKT磷酸化以及细胞迁移，导致细胞增殖减弱和集落形成。RON△85是一种MSP-RON通路的拮抗剂，对于RON/RON△160介导的致肿瘤活性有潜在的调节作用[18]。

上述这些极度活跃的变异体大多有通过不同底物特异性和磷酸化的方式激活多种信号级联反应的能力。它们调节细胞迁移、侵袭和增殖，促进侵袭表型形成和肿瘤演进的同时，也促进针对干扰配体结合的药物的耐药性产生，在RON靶向治疗中造成了障碍[15]。

2.2.2 RON促进细胞迁移

肿瘤基质侵袭之前的细胞迁移是上皮细胞分化、生长和生存的重要步骤。综合上述RON变异体的特性，RON、RON△165、RON△165.e11p和RONE5/6in都能引起EMT，导致上皮细胞由立方形向纺锤形的形态学改变。上皮细胞E-钙粘蛋白表达减少，神经钙粘素、波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达增加，使得上皮源性肿瘤细胞易从原发部位脱落，移动能力加强，进而肿瘤细胞侵袭和转移能力增强[14, 15]。转化生长因子β(TGF-β)和肝细胞生长因子(HGF)也可以诱导EMT发生。RON通过TGF-β和MSP作用诱导EMT的过程可以被PD98059抑制。

2.2.3 RON促进肿瘤细胞附着

研究表明RON在乳腺上皮细胞中的表达增加可促进细胞膜表面透明质烷(hyaluronan，HA)表达，并导致HA介导的细胞附着增强。透明质烷对于MCF-10A型乳腺上皮细胞与多聚赖氨酸在玻璃盖玻片上形成连接意义很大，但对细胞播散过程没有促进作用[9]。早先的数据提示Src激酶对于10A细胞粘附后播散很重要，而与10A型乳腺上皮细胞的附着意义不大，而Src激活也不是HA在这些细胞中的产生的必要条件。现在，有越来越多的实验结果表明显著的炎症过程促进肿瘤的进展[21]。而且有研究表明，HA在包括人类肿瘤在内的炎症性疾病中起关键作用[22]。这种ECM对RTK信号的影响程度仍在积极研究中。

2.2.4 RON促进肿瘤生长和血管生成

血管生成(angiogenesis)是肿瘤赖以生长、转移的基础。RON的激活在多种肿瘤中可导致血管的形成。在上皮癌细胞系中研究RON活性揭示了其在细胞增殖、存活、迁移和EMT中的作用[7]。在小鼠模型中通过MSP过表达[12]或RON过表达[11]来激活RON足以增强肿瘤生长以及转移频率和组织亲和性，MSP/RON的过表达与乳腺癌患者的肿瘤转移增强和死亡有显著关联[12]。相反，在小鼠乳腺癌模型中，RON功能缺失则会影响肿瘤生长、血管形成和转移。RON酪氨酸激酶结构域缺失(Ron TK-/-)时MMTV-PyMT乳腺癌模型中乳腺肿瘤生长减慢，MMTV-PyMT乳腺癌模型唯一的转移位置——肺转移发生率明显降低。上述效应与肿瘤脉管系统的减少和凋亡增强平行出现[3]。总之，RON活性的丧失会削弱肿瘤生长、减少肿瘤转移的可能性，并且应用RON抑制剂的临床前期研究已经显示出有前景的结果。

2.2.5 RON在溶骨性骨转移中的作用

RON还可以表达于破骨细胞。表达MSP/RON的乳腺癌病人出现明显的向肺、肝、脑和骨的转移，其中骨转移最常见。体外人骨髓细胞分化时，RON表达在多核破骨细胞样细胞的表面，MSP激活破骨细胞，导致骨的再吸收[23]。在小鼠模型中MSP诱导的骨转移是溶骨性的，这和在人类乳腺癌病人中发生的是一样的。在体内，RON在成骨细胞表面高度表达，但似乎在骨发育中没有重要作用，因为RON功能缺失的小鼠没有出现明显骨质缺损。MSP在破骨细胞激活中的作用与乳腺癌高度相关，因为70%～80%的乳腺癌病人会发生骨转移，因此骨是该病转移的最常见部位[24]。表达MSP的乳腺癌细胞在体外激活破骨细胞，导致骨基质被侵蚀，其程度远远大于由未表达MSP的对照组肿瘤诱导的情况。此外，具有MSP表达的乳腺癌的小鼠会出现自发性溶骨性骨转移，有高度MSP/RON表达的乳腺癌患者比起MSP/RON表达较低的患者更易发生骨转移[12]。MSP/RON信号转导通路在乳腺癌骨转移中的作用还有待阐明，可能有重要的临床意义。

3 RON靶向治疗在乳腺癌治疗中的潜在价值

使用鼠模型和原发性人乳腺癌样本获得的数据强烈表明RON相关的信号转导通路是治疗乳腺癌的新靶点。MSP/RON不仅在肿瘤发生和进展中起作用，也在各种已知发生于肿瘤微环境的炎症反应中起关键作用。动物实验显示，通过限制肿瘤炎症能明显限制甚至消除肿瘤进展和转移[25]。IMC-41A40和Zt/f2等RON特异性mAb能抑制RON与受体相互作用，使RON表达下调并抑制配体诱导的磷酸化，能降低肿瘤生长速度达50%以上，都还处在临床前期阶段[26]。体内试验发现与5-氟尿嘧啶(5-FU)等细胞毒作用药物合用的Zt/f2能增强前者的肿瘤细胞杀伤作用，并伴随半抑制浓度值(IC50值)的显著下降[27]。有10多种c-MET/RON特异性的小分子抑制物(small-molecule inhibitors，SMIs)正在进行各期临床试验。大多数SMIs都是靶向c-MET的，其中比较有代表性的是ARQ107和PF-02341066。由于RON和c-MET的激酶结构域有68%是相同的，所以c-MET抑制剂往往体现对c-MET和RON的双重抑制，只有IC50的略微差异[26]，如Compound I能以不同IC50分别抑制c-MET和RON，最近也研制出如Compounds 4和Compounds 13的RON特异性SMIs[28]。但是，SMIs的临床应用上还存在问题，一是c-MET和RON的表达改变常共存于在各种肿瘤中，仅特异作用于RON的SMIs的临床可行性还需要进一步探讨；二是体外实验显示，肿瘤细胞对某些SMIs如PF-02341066和Compound I的获得性耐药性的出现[29]，原因可能为c-MET与EGFR家族成员的交流导致肿瘤细胞逃逸SMI介导的细胞毒及抑制作用，或是缺氧诱导的c-MET/RON表达下调促进了对c-MET/RON双重抑制剂Compound I的耐药性获得。有关SMIs耐药性产生的具体机制的研究还在继续。在动物模型中已经证实，通过特殊的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)使RON表达沉默能抑制肿瘤生长[30]。存在c-MET/RON基因扩增和蛋白过表达的结肠癌细胞在经过siRNA治疗后会产生生长抑制、G1-S停止和凋亡。另外有研究发现，姜黄素介导的RON表达抑制也可以阻断MSP诱发的乳腺癌细胞侵袭。数据显示姜黄素通过影响NF-κB p65亚单位蛋白表达和转录活性来降低乳腺癌细胞系中RON表达[30]，从而阻断RON介导的癌细胞侵袭。

4 展 望

MSP/RON信号转导通路有对肿瘤和宿主免疫系统的双重作用。而在动物模型上的临床前期试验中常规使用免疫缺陷小鼠，是抗肿瘤药物发展的一个障碍。如果MSP/RON信号转导通路是通过改变免疫功能来促进肿瘤进展和转移，就很难或者说不可能在这样一个模型中观察到结果[3]。另一个挑战是RON存在多种极度活跃的剪接变异体，RON各种活化形式的上调促进针对干扰配体结合的药物的耐药性产生，再加上c-MET/RON特异性SMIs的获得性耐药性的出现，在RON靶向治疗中造成了障碍。因此，在乳腺癌治疗中，RON靶向治疗面临一定的挑战，但也很有成功的希望。

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