恶性脑胶质瘤U87细胞系肿瘤干细胞放疗敏感性的体外实验研究

赵红宇，徐 东，李 帅，王 倩，刘海君，金 辉，刘云会*

(1中国医科大学盛京医院，沈阳110004;2中国医科大学临床医学系;3中国医科大学临床药理实验室)

恶性脑胶质瘤是常见的中枢神经系统肿瘤，其恶性程度极高，占中枢神经系统肿瘤的60%以上;临床上患者虽经放疗、化疗及手术等干预治疗，但其病死率仍居高不下，中位生存期仅14.6个月［1］。近年研究表明，脑胶质瘤内存在小的细胞亚群——肿瘤干细胞(CSCs)，其具有神经干细胞(NSCs)特性，能进行自我更新、多向分化及体内致瘤，是肿瘤发生、发展的根源［2］。在脑胶质瘤 CSCs成功分离与鉴定的基础上，不断有学者提出CSCs的治疗策略［3］。2007～2008年，我们在成功分离、鉴定 U87恶性脑胶质瘤CSCs的基础上，检测了脑胶质瘤细胞系U87细胞及其CSCs的体外放疗敏感性，旨在探讨CSCs在恶性脑胶质瘤放疗抵抗性中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 脑胶质瘤细胞系U87细胞(中国科学院)，DMEM/F12培养液(Invitrogen公司)，胎牛血清(FBS，GIBCO公司)。NSCs标记物鉴定试剂盒，NSCs表面标记物小鼠抗人CD133单抗、小鼠抗人Nestin单抗、小鼠抗人微管相关蛋白2(MAP2)单抗、兔抗人胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)多抗、小鼠抗人O1单抗，Cy3标记的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗(Chemicon公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 U87细胞培养和传代 将U87细胞接种于含10%FBS的DMEM/F12培养基中，在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。5～7 d后，按1∶2或1∶3比例传代。

1.2.2 CSCs培养和传代 将U87细胞接种于含B27、肝素、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子的无FBS的DMEM/F12培养液中，在 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。待U87细胞增殖形成细胞球3～4 d后，吸取上清培养液 (含细胞球)，重新吹打成单细胞悬液，按1∶2或1∶3比例传代。

1.2.3 CSCs鉴定 原代细胞球形成并达到100～200个细胞后，收集其细胞球，用0.1%胰蛋白酶和1×EDTA在37℃下处理10 min，细胞球分解成单细胞后，转移到96孔培养皿进行培养;稀释细胞悬液为1～2个细胞/孔，观察单细胞克隆能力。将细胞离心后种植于盒式载玻片中，以2%多聚甲醛固定，室温15 min;10%驴血清封闭，室温1 h。以NSCs标记物鉴定试剂盒进行细胞染色，室温孵育2 h;加入Cy3标记的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗，室温孵育1 h。在显微镜下随机选择20个高倍视野进行阳性CSCs计数。

1.2.4 实验分组及照射干预 将传代的U87细胞及CSCs均以随机数字法设立对照组与照射组，对照组不进行照射;照射组分为 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 Gy 剂量组，均在室温下用西门子Primus-M型直线加速器进行照射。

1.2.5 集落形成实验 分别收集两种细胞制成悬液，加入24孔培养皿中，每培养皿接种400个细胞。对照组及照射组细胞均在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养7 d后，用95%乙醇固定、0.25%结晶紫染色，并计数≥50个细胞的集落，计算集落形成率及细胞存活分数(SF，SF=照射组集落形成率/对照组集落形成率)。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，组间率的比较用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 U87细胞生长及CSCs形成、增殖 在FBS的DMEM/F12培养基中，U87细胞呈贴壁生长并交织成网状;转移到无FBS的NSCs培养基中培养5～7 d后，少部分细胞自我增殖呈球状或卵球状悬浮的细胞球克隆，每细胞球有100～200个细胞。初代细胞球细胞分解成单细胞后，重新在NSCs培养液中培养，其细胞均能形成2代细胞球。

2.2 CSCs鉴定 细胞球细胞表达NSCs的表面标记物 CD133、Nestin，而不表达星形细胞标记物GFAP和神经元标记物MAP2，极少表达少突胶质细胞标记物O1。多数分化细胞表达GFAP，少数表达MAP2和 O1。

2.3 X线照射对U87细胞及CSCs的影响 照射组照射0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 Gy剂量时，U87细胞及CSCs的存活率分别由1%逐渐降至0、0.2%。随着照射剂量增加，U87细胞及CSCs的存活率均下降(P＜0.01)，且CSCs的存活率高于U87细胞(P＜0.01)。

3 讨论

近年研究表明［4，5］，恶性脑胶质瘤内具有 NSCs特性的细胞亚群CSCs，在肿瘤发生、发展中发挥了决定性作用。这些细胞在体外可形成克隆球，具有多向分化及体内致瘤能力。本研究结果显示，恶性脑胶质瘤细胞系U87细胞及CSCs接受X线照射后，其细胞存活率均下降，且随着放射剂量增加而细胞存活率逐渐下降;并发现在同一剂量放射线干预下，U87细胞的存活率明显低于CSCs。表明U87细胞系CSCs的放射敏感性明显低于U87细胞，CSCs具有明显的放疗抵抗性。

目前，应用传统的抗肿瘤放疗手段虽能抑制肿瘤细胞增殖，但其作用短暂，且肿瘤容易复发。近年研究认为，因CSCs较其他分化的肿瘤细胞具有更强的放疗抵抗性，故放射线干预仅能杀灭或抑制肿瘤中的非肿瘤干细胞，而对其CSCs则较少或无治疗作用［6］。本研究结果证实了这一现象。

放射生物学理论认为，DNA作为放射线对细胞作用的关键靶点，在放疗机制中发挥重要的作用;DNA损伤程度反映放疗敏感性的强弱，DNA损伤后迅速修复是放疗抵抗性的关键原因［7］。Bao等［8］研究发现，在放射剂量干预下，CSCs的存活比例明显高于肿瘤细胞;并发现CSCs的放疗抵抗性增高是通过首先激活检查点蛋白实现的，应用检查点激酶的特异性抑制剂能抑制CSCs的DNA损伤修复，逆转CSCs的放疗抵抗性。提示CSCs的放射敏感性可能与影响细胞周期调控及信号转导通路改变有密切关系。

综上所述，根据CSCs的放疗抵抗特性，寻找特异性针对CSCs的治疗手段，可能从根本上遏制肿瘤生长;探索针对CSCs的放射增敏，将成为肿瘤放疗极具前途的发展方向。

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［2］苏进，许新华.肿瘤干细胞生物学特性及相关研究进展［J］.肿瘤防治研究，2010，37(4):474-476.

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［4］李明武，牛朝诗，董永飞，等.脑肿瘤干细胞的增殖活性与病理级别的相关性研究［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2009，8(6):542-546.

［5］Ehtesham M，Mapara KY，Stevenson CB，et al.CXCR4 mediates the proliferation of glioblastoma progenitor cells［J］.Cancer Lett，2009，274(2):305-312.

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［7］谷铣之，殷蔚伯，余子豪，等.肿瘤放射治疗学［M］.4版.北京:中国协和医科大学出版社，2008:231-232.

［8］Bao S，Wu Q，McLendon RE，et al.Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response［J］.Nature，2006，444(7120):756-760.