反相高效液相色谱法测定虎杖根中白藜芦醇及其苷的含量

邹盛勤

（宜春学院化学与生物工程学院，江西省天然药物活性成分研究重点实验室，江西 宜春 336000）

虎杖( polygonum cuspidatum siobet Zucc.) 为蓼科属多年生草本植物的根或根茎，在我国大部分地区广泛分布。虎杖性味微寒微苦，归肝、胆、肺经，具有活血定痛、清热利湿、止咳化痰作用。近年来，国内外学者对虎杖的化学成分、药理作用、提取分离做了许多研究，发现其根茎含有多羟基芪类化合物白藜芦醇及其苷，属于单宁质多酚[1]，对人体具有降血脂、抗血栓、预防动脉硬化、增强免疫功能等重要调节作用，是一种极具开发价值的天然物质[2]。据调查，目前市场上的药材主要来源于江西、贵州、四川、江苏、浙江等地区，主要含有蒽醌类化合物、白藜芦醇及苷、水溶性多糖和鞣质等成分，在临床上广泛应用[3,4]。本文建立了同时测定不同根龄虎杖根中虎杖苷和白藜芦醇的定量方法，为客观评价虎杖的质量提供参考依据。

1 仪器和试药

Waters HPLC仪(美国，515泵，2996光电二极管阵列检测器，77251进样阀，Empower中文色谱数据工作站)；SK2510HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司) ；RO-MB-10D高纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂)。甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司），其余试剂均为分析纯，水为超纯水。虎杖苷、白藜芦醇对照品（Sigma公司）。虎杖根采自江西省宜春市，经鉴定为蓼科植物虎杖polygonum cuspidatum的根。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取虎杖苷和白藜芦醇3.58 mg和3.70 mg置10 mL量瓶中，甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，得含虎杖苷和白藜芦醇0.358 mg/mL和0.370 mg/mL的对照品混合溶液，备用。

2.2 样品溶液的制备

虎杖根与80℃下烘干8 h，粉碎过20目筛。精密称取2.0 g虎杖根粉末于50mL容量瓶中，加入50 ml甲醇，称重。超声提取30 min，冷却后补足损失重量，摇匀后用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液作为样品溶液。

2.3 检测波长的选择

采用PAD检测器在190~400 nm波长范围内扫描，虎杖苷在流动相中的最大吸收波长均为216.3和319.2 nm，白藜芦醇在流动相中的最大吸收波长为216.3 和306.1 nm选择319 nm为检测波长，信噪比高，基线平稳，待测组分峰形对称。虎杖苷和白藜芦醇在流动相中的紫外吸收光谱见图1

2.3 色谱条件

色谱柱为Kromasil C18柱(4.6 mm×250mm，5μm)；流动相为甲醇∶1%磷酸水溶液（50∶50），流速为0.8 mL/min，检测波长319 nm，柱温30℃，采用外标法定量分析。虎杖苷和白藜芦醇理论塔板数均大于3000，对称因子分别为1.03、1.05。对照品及样品色谱图见图2。

2.4 精密度试验

分别精密吸取对照品混合溶液10 μL，平行进样5次，以峰面积计算色谱系统精密度，虎杖苷和白藜芦醇峰面积RSD分别为0.42 %(n=5)和0.56 %(n=5)。进样方法和仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取对照品溶液分别于1，2，4，8，12，24 h进样，按上述色谱条件测定峰面积。虎杖苷和白藜芦醇峰面积的RSD分别为0.84%和1.14%。表明样品溶液在24 h内基本稳定。

2.6 重现性试验

取同一虎杖根样品5份，每份各约2.0 g，按样品溶液制备方法制备样品溶液。精密吸取各样品溶液10 μL，进样，测定其峰面积积分值，外标法计算含量，虎杖苷和白藜芦醇含量的RSD分别为1.95 %(n=5)和1.62 %（n=5）。结果表明，样品制备方法重现性良好。

2.7 线性关系考察

精密吸取对照品混合溶液各2.0，6.0，10.0，15.0，20.0 mL进样分析，按色谱条件测定峰面积，以对照品的进样量(μg)为横坐标，峰面积(μV·s)为纵坐标，绘制标准曲线，得虎杖苷回归方程为：Y=3.02×105X-1.84×104（r=0.9996），线性范围0.716~7.160 μg，LOD（检测限）为0.92 ng，LOQ（定量限）为2.61 ng；白藜芦醇回归方程为：Y=3.40×105X-2.16×104（r=0.9998），线性范围0.740~7.400 μg，LOD为0.85 ng，LOQ为2.17 ng。

2.8 加样回收试验

精密称取已知含量的虎杖根样品6份，每份约1.0 g，分别加入虎杖苷和白藜芦醇对照品适量，按样品制备方法制备样品溶液，进样测定含量，虎杖苷平均回收率为99.7 %，RSD为1.81 %（n=6）；白藜芦醇平均回收率为98.5 %，RSD为2.02 %（n=6）。

2.9 样品含量测定

取不同根龄虎杖根药材，按“2.2”项下方法制备样品溶液，准确吸取20μL，进样分析，平行测定3次，外标法计算各样品中虎杖苷和白藜芦醇的含量。样品测定结果见表1。

表1 不同根龄虎杖根中虎杖苷和白藜芦醇含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 测定结果表明，不同根龄虎杖根样品中白藜芦醇及其苷的含量差异较大，虎杖苷和白藜芦醇在根龄2~3年间含量均最高，虎杖苷的含量约为白藜芦醇的4倍。提示虎杖根的最佳采收期为根龄2~3年，期间其主要活性物质芪类化合物及其苷总含量最高。

3.2 在样品预处理时，保持其他提取条件不变，考察了提取次数对样品中虎杖苷和白藜芦醇提取率的影响。经测定比较，第2次提取液中虎杖苷的峰面积为第1 次提取液的2.46 %，白藜芦醇的峰面积为第1次提取液的2.22%，可认为提取1 次后，虎杖根中虎杖苷和白藜芦醇已基本提取完全。故样品溶液的制备均采用甲醇超声提取30 min。

3.3 本文建立了同时测定不同根龄虎杖根中的2种主要有效成分含量的反相高效液相色谱定量方法，虎杖苷和白藜芦醇获得基线分离，且具有快速、准确、重复性好等特点，可用于虎杖药材的质量控制。

[1] 潘明新,王小阳.虎杖的化学成分及其药理作用[J].中药材,2000,23(1):56-58.

[2] 肖凯,宣利江,徐亚明,等.虎杖的化学成分研究[J].中国药学杂志, 2003, 38(1): 12-15.

[3] 黄远芬,李蓓蓓,罗霄山.虎杖及其有效成分药理作用研究进展[J].广东药学, 2000,10(6): 13-15.

[4] 杨红美,陈波,曾建国,等.HPLC同时测定虎杖及其提取物中4种有效成分的含量[J].中国中药杂志,2006,31(3):202-205.