强脉冲光对人皮肤MMP-1、MMP-8及TIMP-1表达的影响

袁 宁 赵俊英

(首都医科大学附属北京友谊医院皮肤科，北京 100050)

光子嫩肤技术是使用连续波长的强脉冲光(intense pulsed light，IPL)在低能量密度下进行的非剥脱性、非侵入性嫩肤治疗技术。作为一种无创的嫩肤手段，近年来深受广大患者及从业医生的青睐。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是参与细胞外基质降解的主要蛋白酶。基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是一族内源性抑制因子，可以高度地、有选择地抑制MMPs或其前体而表现出许多生物学活性，2者维持着细胞外基质的平衡。

本实验通过采用免疫组化法检测光照前后人皮肤中MMPs和TIMP的表达，以明确2者在旧基质的降解和新生基质的重排过程中所起的作用，通过基质与酶的变化的相关性研究，进一步阐述强脉冲光光子嫩肤的作用机制。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取6名就诊于首都医科大学附属北京友谊皮肤科的患者，皮肤类型为Ⅲ～Ⅳ型(Fitzpatrick分型)，年龄28～46岁，男7例，女3例。患者均签署病理学取材的知情同意书。

1.2 主要仪器

全自动脱水机、自动石蜡包埋机、石蜡切片机、电热恒温烤箱(均来自德国Leica公司)，光学显微镜及照相系统(日本Olympus公司)，Lumenis One光子嫩肤仪(美国科医人公司)。

1.3 主要试剂

兔抗人基质金属蛋白酶I单克隆抗体、兔抗人基质金属蛋白酶Ⅷ单克隆抗体(武汉Boster公司)，兔抗人血管内皮生长因子单克隆抗体、兔抗人金属蛋白酶组织抑制因子Ⅰ多克隆抗体、试剂A聚合物辅助剂、试剂B辣根酶标记山羊抗兔/小鼠IgG多聚体(北京中杉金桥公司)。

1.4 研究方法

志愿者照光部位(2例为左腹部，4例为上肢)0.9%氯化钠注射液清洁后，皮肤表面涂IPL冷凝胶，进行强脉冲光嫩肤治疗。根据受试者Fitzpatrick分型、肤色、皮损性质、部位、密度等制定个体化治疗方案，选择恰当的IPL治疗参数560 nm/590 nm的滤光片，采取单/双/三脉冲的不同脉冲方式，脉宽为2.0～4.0 ms，脉冲延迟为 25～40 ms，能量密度为 16-20 J/cm2，治疗间隔为3周，治疗次数为3～4次。

1.5 组织学观察

分别于照光部位及其周边非照光部位各取1块皮肤，裁剪成约5 mm×5 mm×5 mm大小，2例志愿者3次治疗后2周病理取材，2例3次治疗后3周病理取材，2例4次治疗后3周病理取材。所有皮肤样本均以10%甲醛缓冲固定液固定待用。固定的标本石蜡包埋、切片，厚度3 μm，APES胶片捞片后置烤箱60℃，进行常规免疫组化染色。光镜下观察。

1.6 结果判断

MMP-1、MMP-8、TIMP-1表达阳性时，在切片中可见胞质内有深浅不同的棕黄色颗粒，按照所有标本的平均染色强度由无到强划分为 －，+，++，+++四级［1］。

2 结果

2.1 MMP-1在皮肤中的表达

抗原阳性时在切片中可以看到棕黄色颗粒。从切片中可以看到，正常皮肤中无MMP-1表达(图1A，颗粒层深色颗粒为色素沉着)，3次IPL照射后2周阳性表达较照射前增强(图1B)，3周时的表达较照射前也有所增强(图1C)，但弱于照射2周时的表达。从图1B、1D可以看出，4次IPL照射后皮肤中的MMP-1阳性表达较3次IPL照射后的表达多。图1B显示，腹部皮肤经IPL照射后，MMP-1的表达也有所改变。

2.2 MMP-8在皮肤中的表达

抗原阳性时切片中可以看到棕黄色颗粒。正常皮肤中无MMP-8表达(图2A)。3次IPL照射后2周有阳性表达，真皮中可见表达阳性棕黄色颗粒(图2B)，照射后3周时皮肤真皮中也有所表达(图2C)，但弱于照射2周时的表达。4次IPL照射的皮肤真皮中阳性表达(图2D)强于3次照射后的表达。图2D示腹部皮肤照射前后的MMP-8的表达也有所改变。而且，整体看来，MMP-8在真皮中的表达弱于MMP-1的表达。

2.3 TIMP-1在皮肤中的表达

正常皮肤中无TIMP-1表达(图3A)，3次IPL照射后2周真皮有阳性颗粒出现(图3B)，第3周时的表达较照射前也有所增强(图3C)，与2周时的表达相比无明显改变。4次IPL照射后2周时真皮层有较多阳性颗粒出现，并有成纤维细胞表达阳性(图3D)。

3 讨论

皮肤老化一直是人们关注的热点问题。光子嫩肤技术是使用连续的强脉冲光在低能量密度下的非消融性方式的嫩肤治疗，简言之是采用强光源对光老化的皮肤进行改善。Anderson R R等［1］在1983年首次提出光子嫩肤作用机制为选择性光热解效应:如果皮肤中的病损组织对光辐射产生选择性吸收，并将产生的热能限制在一定空间内，那么在此区域内的生物组织受到热破坏，而周围的正常组织不受损害，病损组织吸收热能被分解，并通过代谢吸收分解产物。

正常皮肤中最为丰富的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分就是胶原，最丰富的胶原类型是Ⅰ型胶原，占皮肤胶原的80%～85%，且是人体的主要结构蛋白，其次是Ⅲ型胶原，占10%左右。而光老化的主要组织学特征是皮肤基质构成的改变，即胶原成分的减少和异常弹性纤维沉积［2］。此时重建结缔组织，这需要细胞外基质组成成分的降解和清除，以及新成分的合成和沉积。所以，胶原的合成和降解在此过程中的重要性是显然的。

许多酶可降解ECM中的胶原成分，分为4大类:丝氨酸蛋白酶类、半胱氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类、基质金属蛋白酶类。其中，MMPs是一组降解ECM的最重要的蛋白酶［3-4］。

图1 MMP-1在皮肤中的表达免疫组化染色Fig.1 Expression of MMP-1 in skin with immunohistochemical staining(HE stain 10×)

其中MMP-1，MMP-8以Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白为底物。在正常机体中，MMPs的活性非常低并由内源性的组织抑制剂TIMPs调节。TIMPs是阻断ECM降解、抑制MMP活性的一组分泌糖蛋白。它是一个多基因家族的编码蛋白，由成纤维细胞、角质细胞、单核-巨噬细胞、内皮细胞等产生，广泛分布于组织和体液中。目前已被成功克隆出 4个成员:TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4［5-7］。TIMP 在组织重塑中的主要作用是与MMP形成1∶1复合物从而抑制MMP的能力。2者维持着细胞外基质的平衡。虽然每种TIMP均可抑制所有的MMP，但TIMP-1可优先抑制MMP-1。

本实验前期研究［8］对IPL治疗前后弹力纤维的图像定量分析结果显示其面积密度以降低为主，但肉眼观察切片中聚集成团块状的弹力纤维消失，取而代之的是较为纤细、分布更广、排列更加均匀整齐的新的弹力纤维，另外Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维的面积密度以增加为主，且其排列更加整齐并交织成规则的网状结构，纤维间间隙明显缩小，纤维排列致密，纤维的直径明显变细，说明胶原纤维为更加幼稚的新生的胶原纤维。我们怀疑是某些细胞在接受光能后分泌某种酶及细胞因子，刺激新的胶原生成。到目前为止，研究IPL的分子生物学机制方面的报道还很少，因此有必要进行较深入的该方面研究，这对于IPL的应用将有重要的理论意义。

本实验表明正常皮肤中无MMP-1表达，IPL照射后真皮中发现MMP-1及MMP-8的表达增强，此时MMP-1及MMP-8的表达有利于清除变性的胶原。而照射后3周时的阳性表达弱于照射2周时的表达，这时有利于新的胶原纤维形成，这与我们前期实验观察切片中特染组织的面积及厚度的改变，发现第3周时Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的改变呈上升趋势相吻合。同时，从本研究结果可以显示，4次IPL照射后皮肤中的MMP-1阳性表达较3次IPL照射后的表达强。所以，增加治疗次数，将会清除更多的变性Ⅰ、Ⅲ型胶原，从而有更多新生胶原纤维生成。

图2 MMP-8在皮肤中的表达免疫组化染色Fig.2 Expression of MMP-8 in skin with immunohistochemical staining(HE stain 10×)

正常皮肤中TIMP-1无表达，IPL照射后真皮有阳性颗粒出现，但第2周和第3周时真皮内表达差异无统计学意义，有成纤维细胞表达阳性。

TIMP-1的一个重要作用就是抑制 MMP-1及MMP-8对ECM成分的降解。实验中我们发现MMPs在2周时的表达强于3周时的表达，而TIMP-1在真皮中的表达在第2周和第3周无明显差异，这表示，在2周前主要是以清除变性胶原为主，而2周后，TIMP抑制MMPs对胶原的过多降解，有利于真皮中新生基质成分的沉积，对皮肤的重塑是有意义的。此过程中，TIMP-1一直起监察员的作用。

国内王明利等［9］对大鼠皮肤的强脉冲光实验研究也证实了这一变化，但是我们未观察到强脉冲光治疗后这些酶在汉族人皮肤上的强阳性表达，考虑可能与以下因素有关:① 照射对象及部位:前者是大鼠背部皮肤，本实验是汉族人的上肢及腹部皮肤。② 治疗参数:前者通过测试光斑，用了相同的治疗参数:能量密度34 J/cm2，脉宽各为4、5及6 ms，脉冲延时为20 ms及25 ms。本实验根据受试者Fitzpatrick分型、肤色、部位等制定个体化治疗方案，选择恰当的IPL治疗参数:560 nm/590 nm的滤光片，采取单/双/三脉冲的不同脉冲方式，脉宽为2.0～4.0 ms，脉冲延迟为25～40 ms，能量密度为16～20 J/cm2，这与我们在临床应用时所用的治疗参数是相似的。

研究者还观察到，腹部皮肤经IPL照射后的MMP-1、MMP-8及TIMP-1在真皮中表达也增强，且其规律性和光暴露部位(上肢)的阳性表达相似，因此认为IPL不仅能治疗光老化，并且对自然老化也有一定的疗效。

本实验观察了IPL作用于人皮肤中的MMP-1、MMP-8及TIMP-1的表达变化，表明3者在光子嫩肤导致的热损伤中起一定的作用，为阐明IPL的分子生物学机制提供了一定的理论基础。IPL的分子生物学机制还涉及很多的酶和因子，本实验只观察了3种酶的变化，其他酶和因子在IPL作用机制中的变化及相关关系还有待于进一步的研究。

图3 TIMP-1的表达免疫组化染色Fig.3 The expression of MMP-8 in skin with immunohistochemical staining(HE stain)

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［3］Duarte A S，Pereira A O，Cabrita A M.The characterisation of the collagenolytic activity of cardosin a demonstrates its potential application for extracellular matrix degradative processes［J］.Curr Drug Discov Technol，2005，2(1):37-44.

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［8］冯育洁，赵俊英.强脉冲光嫩肤疗效评价及病理变化的研究［J］.中华医学杂志，2007，87(20):1394-1397.

［9］王明利，柳大烈.强脉冲光对大鼠皮肤胶原蛋白及其调控因素的影响［D］.西安:第四军医大学，2005.