APP5肽类似物P165和罗格列酮对SH-SY5Y细胞IRS-1和p-CREB表达的影响

张景燕 王 蓉 赵静姝 姬志娟 赵志炜 盛树力

(首都医科大学宣武医院中心实验室，老年病医疗研究中心，神经变性病教育部重点实验室，北京 100053)

散发性老年性痴呆(sporadic Alzheimer disease，SAD)是一种常见的神经系统退行性疾病，其主要临床表现为进行性认知功能下降和行为异常。脑内糖代谢障碍可以引起认知功能受损，而AD病人也常伴有脑内糖代谢障碍［1］。AD 发病的关键因素Aβ的产生及分泌与糖代谢障碍之间有非常密切的关联，并且可以相互促进［2］。胰岛素通过与细胞膜上的胰岛素受体(insulin receptor，IR)相结合，通过胰岛素信号转导过程，调控细胞内特定的生理生化反应。近年越来越多的研究［3］表明，脑内胰岛信号转导通路异常在SAD的发生、发展过程中具有重要作用。

胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)和磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(phosphated-cAMP response element binding protein，p-CREB)是胰岛素信号转导通路中的关键环节［4］。在以往的系列研究［5-6］中发现，本课题组自行设计合成的APP5肽类似物P165以及胰岛素增敏剂罗格列酮具有明确的神经保护作用，并可能与其改善胰岛素的信号转导有关。本实验应用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)损伤人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞模型，观察APP5肽类似物P165和罗格列酮对胰岛素信号通路相关因子IRS-1和p-CREB表达水平的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1)细胞株:人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞来自瑞典卡罗琳斯卡医学院。

2)试剂:链尿佐菌素购自Merck公司，罗格列酮购自葛兰素史克公司，APP5肽类似物P165由本室自行设计，固相法合成，高效液相色谱纯化(HPLC)。

IRS-1、p-CREB抗体由本室合成多肽片段，经HPLC纯化后与血兰蛋白交联，免疫兔获得抗血清。山羊抗兔IgG/Dylight购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1)细胞培养:用含10%胎牛血清的MEM培养基，于37℃ ，5%CO2培养箱中培养，6 d传代1次，中间换液1次。

2)细胞实验:将生长良好、传代稳定的SH-SY5Y细胞以2×103/mL的密度接种于48孔板(Nunc产品)，每孔体积500 μL，48 h后分为4组进行实验。包括:对照组、STZ神经元损伤模型组(STZ 0.8 mmol/L)、罗格列酮保护组(STZ 0.8 mmol/L+罗格列酮20 μmol/L)，APP5肽类似物 P165保护组(STZ 0.8 mmol/L+P165 30 μmol/L)，各组细胞数及培养液体积均相等。

3)培养细胞形态观察:倒置显微镜下观察培养的细胞，比较实验组和对照组细胞的形态。

4)免疫细胞荧光染色:将生长良好、传代稳定的SH-SY5Y细胞以2×103/mL的密度接种于48孔板(Nunc产品)，每孔体积500 μL，当细胞生长至70%～80%汇合率时，终止培养。PBST洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBST洗5 min×3次，5%山羊血清封闭1 h，分别加入一抗，即IRS-1抗体(1∶200)、p-CREB抗体(1∶200)。4 ℃过夜，PBST洗5 min×3次，滴加相应的二抗(1∶200)，常温避光反应2 h，PBST洗5 min×3次，荧光倒置显微镜下观察并采集图像。用显微图像分析系统对各组进行图像分析，每组随机选取300个细胞，采用image-pro plus图像分析软件测量平均吸光度(OA)值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，结果以中位数(M)和四分位数(P25，P75)表示，因数据为非正态分布资料，故采用多个独立样本比较的秩和检验，组间两两比较校正后检验水准α为0.008，以P＜0.008为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态观察

接种后的SH-SY5Y细胞呈单个细胞，密度均匀漂浮在培养液中，体积较小、圆形、透亮，24 h贴壁后细胞长出较长突起，呈梭形、不规则的三角形或多边形。至第3天与对照组相比，STZ损伤组细胞生长分裂减慢、突起缩短，细胞胞体皱缩。APP5肽类似物P165保护组和罗格列酮保护组突起伸展，细胞形态和细胞胞体皱缩现象与STZ损伤组相比有所改善。

2.2 IRS-1和p-CREB抗体的免疫细胞荧光染色

IRS-1和p-CREB抗体免疫荧光染色后，细胞呈淡绿色荧光，说明SH-SY5Y细胞中存在IRS-1和p-CREB的表达。与对照组相比，STZ损伤组细胞荧光强度较弱，而P165保护组和罗格列酮保护组细胞荧光强度较强(图1，2)。

平均吸光度值测定结果显示:与对照组相比，STZ损伤组IRS-1和p-CREB平均吸光度值降低(P＜0.008)，与STZ损伤组相比，P165组和罗格列酮组平均吸光度值有所上升，差异均有统计学意义(P＜0.008)(表1，2)。

表1 APP5肽类似物P165和罗格列酮对STZ损伤人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞IRS-1表达的影响Tab.1 Effects of P165 and rosiglitazone on the expression of IRS-1 in SH-SY5Y

表2 APP5肽类似物P165和罗格列酮对STZ损伤人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞p-CREB表达的影响Tab.2 Effects of P165 and rosiglitazone on the expression of p-CREB in SH-SY5Y

3 讨论

SH-SY5Y细胞来源于人神经母细胞瘤，其细胞形态及生理、生化功能与正常神经元相似，并且存在胰岛素受体和胰岛素信号通路相关蛋白，已广泛用于神经生物学的研究［7］，因此，我们应用 STZ损伤 SHSY5Y细胞的胰岛素受体，制备神经元胰岛素信号通路障碍的损伤性模型，从而观察与老年性痴呆发病机制密切相关的胰岛素信号转导通路关键蛋白的变化。

APP5肽类似物P165是本课题组自行设计合成、并进行结构改造的小分子神经营养肽，前期工作［6，8］证明，其具有改善脑内胰岛素抵抗、保护神经细胞的作用。本研究通过细胞形态的观察以及免疫细胞荧光染色的分析，探讨在胰岛素受体损伤导致胰岛素信号转导障碍情况下，胰岛素信号转导相关蛋白IRS-1和p-CREB表达的变化，并进一步观察APP5肽类似物P165对上述指标的干预作用，结果表明，P165可以提高IRS-1和p-CREB的表达，改善神经元生长状态。

罗格列酮(rosiglitazone)属噻唑烷二酮类化合物(thiazolidinediones，TZDs)，作为胰岛素增敏剂，可增加组织细胞对胰岛素的敏感性，降低胰岛素抵抗［9］。Pedersen W A等［10］观察了罗格列酮对Tg2576小鼠(一种AD的转基因动物模型)的作用，发现治疗6周，虽不能改变淀粉样斑块的病理变化，但可以选择性地降低脑Aβ42的水平，本课题组的前期工作也发现其具有保护神经元的作用［5］。在本次实验中，同样观察了此药物对胰岛素信号转导蛋白的影响，结果显示，罗格列酮可以改善IRS-1和p-CREB的表达水平。

综上所述，本课题组自行设计的APP5肽类似物P165及胰岛素增敏剂罗格列酮可能通过增加IRS-1、p-CREB的表达来改善STZ对于SH-SY5Y细胞的损伤，从而达到保护神经元的作用。

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