PGN激活BV2内吞Aβ寡聚体后对PC12的影响

姜 新 谢 明 白丽娟 陈晓虹 马恩龙

(1.辽宁省人民医院神经内科，沈阳 110016;2.沈阳药科大学药学院药理教研室，沈阳 110016)

小胶质细胞在脑部炎性反应、脑缺血、阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)等多种中枢神经系统病变时被激活，发挥损伤和修复的双重作用，AD中小胶质细胞作用也存在争议，不同试验结果不完全一致，甚至相反［1-7］。本研究用肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、β 淀粉样蛋白(amyloid protein β，Aβ)1～42寡聚体处理BV2细胞后通过筛网与PC12细胞(代替神经元)共育，筛网允许二者分泌的活性物质自由通过，使细胞间彼此影响，但细胞不能通过，应用此模型，探讨PGN激活BV2内吞Aβ1～42寡聚体后对PC12的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1)BV2与PC12细胞株:购自中国科学院细胞生物研究所，细胞株来源于德国DSMZ(German collection of microorganisms and cell cultures)，分别采集于小鼠脑小胶质细胞瘤和小鼠肾上腺嗜铬细胞瘤。

2)主要试剂和仪器:胎牛血清(美国GIBCO公司)，1640培养基(美国 GIBCO 公司)，Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培养基(美国GIBCO公司);Aβ1～42(美国Sigma公司);无酚红F12培养液(美国GIBCO公司);六氟丙醇(hexafluoro isopropyl，HFIP)(美国Sigma公司);PGN(美国Sigma公司);噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)(上海华舜生物工程有限公司);细胞转移筛网(美国 BD Falcon公司);抗 tau(pS396)抗体(美国Sigma公司);BCA蛋白定量试剂盒(美国PIERCA公司);流式细胞仪(德国Leica公司);96孔酶标仪(瑞士Sunrise Tecon公司)。

1.2 方法

1)Aβ1～42寡聚体的制备:① 制备 Aβ1～42寡聚体:22.2 μL 冷却的 HFIP 加 1 mg Aβ1～42室温孵育 60 min，将肽-HFIP溶液放置冰上10 min后，使HFIP在室温下挥发，过夜。置于真空冷冻干燥机内60 min，除去所有HFIP，分装后于 －80℃保存。② 冰上用100%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配 5 mmol/L Aβ:4.44 μL 新鲜脱水 DMSO 加 0.1 mg 多肽。加439.56 μL无酚红F12培养液稀释至终浓度为50 μmol/L，4℃孵育24 h。4℃ 14 000 r/min离心10 min，转移上清至新管，即为寡聚体。

2)细胞培养:① PC12细胞培养:PC12细胞置于1640培养液(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 g/L链霉素)，37℃，5%CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后传代培养。② BV2细胞培养:BV2细胞置于DMEM培养液(含10%胎牛血清)中，37℃，5%CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后传代培养。

3)细胞共育过程:① 分组:A组为BV2+PC12;B组为Aβ+PC12;C组为Aβ+BV2+PC12;D组为PGN+BV2+PC12;E组为PGN+Aβ+BV2+PC12。② 细胞共育过程:PGN、Aβ1～42寡聚体实验前三天BV2细胞以1×104/孔在转移筛网上培养;实验前一天将PC12细胞以1.5×105个/孔种植于24孔培养板中培养;实验前一天分别将 Aβ1～42寡聚体(1 μmol/L)、PGN(20 μg/mL)加入 C、D 组 BV2 细胞，PGN(20 μg/mL)加入E组 BV2细胞预孵育1 h后再加 Aβ1～42寡聚体(1 μmol/L);上述各组均孵育24 h;除去PC12细胞培养液，将生长有BV2细胞的转移筛网及培养液同时移入PC12细胞24孔培养板中与PC12细胞共育24 h。

4)PC12细胞抑制率:采用MTT方法检测，弃去PC12上清液，设置3个重复孔和无细胞培养基对照，加入MTT(终浓度0.5 mg/mL)，置于37℃培养箱内孵育4 h，细胞内见到蓝色沉淀后，小心吸出培养上清液，每孔加入100 μL DMSO，使结晶物充分溶解，经全自动酶标仪于490 nm处检测OD值。

5)各组PC12细胞tau(pS396)蛋白表达情况:(1)样品的制备:将蛋白裂解缓冲液(预冷至0℃)加入经过漂洗的PC12细胞中，静置20 min;用细胞刮棒收集细胞，连同裂解缓冲液一起转移至经过冷却的微量离心管中;于4℃以12 000 r/min离心2 min;将上清液转移至另一个微量离心管中，保存于－80℃待用。(2)蛋白定量分析BCA(bicinchonic acid asay):A、B、C试剂按照 50∶50∶2比例混合后配制为工作液。梯度稀释BCA标准品，分别吸取待测样品及梯度蛋白到微孔板对应孔中，稀释混匀后在37℃孵育30 min。以96孔酶标仪于570 nm处检测OD值，经数据处理后得出各样本蛋白浓度。(3)蛋白质印迹(Western blotting)分析:① 制备凝胶;② 点样，每孔加样25 μL 2 mg/mL样本;③ 电泳，浓缩胶80 V，分离胶120 V;④转膜:使用Bio-Rad半干转印系统于4℃ 50 V，30 mA转移2 h;⑤检测:取出膜，封闭1～2 h，在室温下将tau(pS396)及tau一抗1∶1 000比例稀释于封闭缓冲液中，4℃过夜。室温下将二抗按1∶4 000比例稀释，孵育60 min;化学发光显色，计算机扫描分析。

6)流式细胞仪对细胞周期的检测:收集细胞，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)清洗3次;1 000 r/min离心10 min，收集细胞沉淀;细胞沉淀中加入70%乙醇2 mL，－20℃固定过夜;1 000 r/min离心10 min，收集细胞沉淀;加入PI染色液1 mL;上机，每组均设3例标本。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 PC12 的生长

PC12细胞株培养初期，呈成簇状、多角形半悬浮生长。传代1代以上细胞贴壁生长，部分细胞呈分化趋势，有伪足伸出，有的伪足较长，甚至连接在一起，细胞倾向于呈小簇状生长(图1)。

2.2 PC12细胞抑制率

PGN激活BV2细胞内吞Aβ增多后，与对照A组相比，对PC12细胞增生有抑制作用(P＜0.05)。详见表1，图2。细胞抑制率%=〔1－(OD实验组/OD对照组)〕×100%。

图1 PC12的生长Fig.1 The growth of PC12(200×)

表1 MTT方法检测PC12细胞抑制率Tab.1 The results of PC12 cell inhibition with MTT method()n=3

表1 MTT方法检测PC12细胞抑制率Tab.1 The results of PC12 cell inhibition with MTT method()n=3

Blank:PC12;A:BV2+PC12;B:Aβ +PC12;C:Aβ +BV2+PC12;D:PGN+BV2+PC12;E:PGN+Aβ +BV2+PC12;n=3;*P ＜0.05 vs bland;△ P ＜0.05，group A、B、C、D vs group E;▼ P ＜0.05，group B、C、D vs group A;#P ＜0.05 group C vs group B.

Item Blank A B C D E OD value 0.811 ±0.005 0.752 ±0.006＊△ 0.557 ±0.004＊△▼ 0.468 ±0.007＊△▼# 0.508 ±0.005＊△▼ 0.289 ±0.007*

图2 各组PC12细胞抑制率比较Fig.2 Comparison of PC12 cell inhibition in each group

2.3 PC12细胞tau(pS396)、tau蛋白表达情况

以Western blotting检测可见E组tau(pS396)表达量高于其他组，而总tau表达量在各组间未发现明显差异(图3)。计算各组磷酸化tau与总tau比值以确定tau激活程度，结果详见表2。E组tau磷酸化激活程度同各组相比差异有统计学意义(P＜0.01)，提示PGN激活BV2细胞内吞Aβ后，加重PC12细胞的损伤。

2.4 流式细胞仪检测PC12细胞凋亡

图3 Western blotting检测PC12细胞tau(pS396)、tauFig.3 tau(pS396)and tau of PC12 cells determined by Western blotting

结果显示，E组PC12细胞凋亡率与各组相比差异有统计学意义(P＜0.01)，PGN激活BV2细胞内吞Aβ后，加重PC12细胞的凋亡，结果详见图4，图5。

3 讨论

小胶质细胞被认为是中枢神经系统(central nervous system，CNS)中最有代表性的免疫细胞［8］，它可在CNS病变时被激活，主要通过分泌或促进神经保护因子的表达［9-12］发挥神经保护作用，通过自身分泌的自由基或促进促炎因子释放而发挥其神经毒性作［13-14］。小胶质细胞参与AD炎性反应是一把双刃剑［15］。在前炎性介质及神经毒性物质的刺激下小胶用质细胞被激活，可以分泌神经营养因子或神经毒性因子，对神经元细胞保护或损伤起直接作用，小胶质细胞被认为不仅能促进Aβ斑块形成同时在不同实验条件下能清除Aβ。

表2 各组tau(pS396)/总tau比值列表Tab.2 The list of the ratio of each value of tau(pS396)divided by the total value of tau()n=3

表2 各组tau(pS396)/总tau比值列表Tab.2 The list of the ratio of each value of tau(pS396)divided by the total value of tau()n=3

A:BV2+PC12;B:Aβ +PC12;C:Aβ +BV2+PC12;D:PGN+BV2+PC12;E:PGN+Aβ+BV2+PC12;n=3;*P ＜0.05 vs group E;△ P ＜0.05，group D、B、C vs group A;#P ＜0.05，group C vs group B.

Item A B C D E tau(pS396)/〔 tau+tau(pS396)〕 11.257 ±0.296* 25.703 ±0.280＊△#35.468 ±1.263＊△ 31.933 ±0.719＊△50.283 ±1.851

图4 流式细胞仪检测各组PC12细胞凋亡Fig.4 The apoptosis of PC12 cells determined by flow cytometry

图5 各组PC12细胞凋亡检测结果Fig.5 The result of the apoptosis of PC12 cells of each group

PC12细胞来自鼠肾上腺素嗜铬细胞瘤细胞系，被广泛用作研究神经细胞的模型。细胞筛网网孔径8 μm，筛网上下细胞可通过分泌的活性物质相互影响。本研究利用它将BV2细胞与PC12细胞共育，既部分模仿体内环境，又不影响对PC12细胞进行各项指标检测，较目前采用较多的只转移培养上清或直接两种细胞共育培养的方法有明显优势。既往研究观察前炎性介质对小胶质细胞的双重作用［15-20］少有神经元共育的报道。本研究利用细胞转移筛网构建BV2细胞与PC12细胞共育体系，并用PGN、Aβ1～42寡聚体分别作用或共同作用于BV2细胞及PC12细胞，制作体外AD模型，探讨PGN激活BV2内吞Aβ42寡聚体后对PC12细胞的影响，是比较接近体内状态的细胞培养模型。

经Aβ1～42寡聚体处理后 PC12细胞，突起减少，PC12细胞抑制率增加，tau蛋白异常磷酸化水平增加，凋亡增多。Tau蛋白是神经元微管蛋白的组成成分，其异常磷酸化后导致微管形成障碍，影响神经元有丝分裂和营养物质运输等功能，引起神经元凋亡［15］。上述结果提示 Aβ1～42寡聚体具有神经毒性，可引起神经元损伤。

PGN 激活 BV2 内吞 Aβ1～42后，加重 Aβ1～42引起PC12的抑制率，tau蛋白异常磷酸化水平，细胞凋亡的增多。提示PGN激活BV2细胞可引起PC12细胞损伤，BV2细胞放大β淀粉样蛋白对PC12细胞损伤，小胶质细胞在AD中促进损伤，加重病情作用。PGN与Aβ1～42寡聚体共同作用于BV2细胞后，增加 BV2细胞内吞Aβ1～42寡聚体后IL-1 β分泌增多，明显加重对PC12细胞的损伤，加速tau蛋白异常磷酸化，促进神经元凋亡。说明前炎性介质刺激小胶质细胞后，表现出其双重性，既增加其内吞Aβ清除Aβ的能力，又促进其分泌炎性介质的能力，最终平衡倾向于损伤作用，结果引起神经元损伤。本研究结果与其他研究［15］有相似之处，炎性介质肿瘤坏死因子α刺激小胶质细胞，降低清道夫受体A(scavenger receptor A，SRA)、CD36的表达，减少对Aβ内吞，提示小胶质细胞分泌的炎性介质反过来促进Aβ产物形成，降低Aβ清除，增加Aβ积累，加速神经变性进展。综上所述，在AD的发病机制中，小胶质细胞起到促进神经元损伤、死亡，促使AD发生发展，前炎性介质对小胶质细胞激活促使其双重性倾向于损伤作用，提示将来对AD抗炎治疗要考虑其双重功能。

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