双孢蘑菇菌种液氮保种方法的研究*

李洪荣

（福建农业科学院食用菌研究所，福建 福州 350014）

菌种保藏的目的是保持菌种高产优质的优良性状，尽量减少或降低菌种的衰退速度和死亡率，使菌种保证统一和不被污染，能够长期或较长期地在生产中应用。因此菌种保藏工作是我所遗传育种研究室长期研究的课题。菌种保藏的基本原理是采用低温干燥、真空隔氧的方法，来控制菌丝的繁殖和减慢菌丝代谢的速度，使它处于休眠和半休眠状态，常用的保种方法有低温斜面保藏、液体石蜡法保藏、硅胶保藏、冷冻干燥保藏、蒸馏水保藏和液氮超低温保藏方法等，其中液氮保藏方法经过30年来的研究证实是一种最稳定、长效的微生物菌种保藏手段，蘑菇菌种的液氮保藏方法研究最早在美国模式菌种库ATCC和宾州大学进行，Hwang于 1972年应用超低温技术保藏蘑菇菌种的初步结果表明是有希望的[1]，随后San Antonio于1978年报道了应用液氮成功地保藏蘑菇菌种达9年之久，其生存能力和蘑菇产量不受影响[2]。

Jodon等也报道了8个商业栽培双孢蘑菇品种液氮保藏10年后，没有明显的形态和生理特性的变化[3]。英国温室作物研究所Challen MP等对蘑菇菌种的保藏进行了系统的研究，认为液氮可长期保存蘑菇菌种，并于1986年发表了液氮菌种使用聚丙烯吸管安瓿的保藏容器的改进。我国中科院微生物研究所陈燕妍，于1987年进行了担子菌菌种24属43种122株的液氮超低温保藏的研究，结果表明不同冷冻保护剂对菌株存活率有很大的影响，冷冻的快慢、解冻的快慢也是影响菌株存活率的主要因素之一[5]。Suman BC、Sobieralski K等报道双孢蘑菇菌种经过液氮保藏后，蘑菇菌丝生长速度及产量均不会受到影响[6，7]。本文对双孢蘑菇菌种的液氮保藏方法进行了系统研究，并经过成活率测定及出菇栽培的验证，以其获得双孢蘑菇菌种液氮保藏的有效方式。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

双孢蘑菇菌株As2796、As4607，由福建省农科院食用菌研究所种质资源与遗传育种研究室保藏提供。

1.1.2 液氮保藏的基质

PDA、小麦、小米等。

1.1.3 冷冻保护剂

5%、10%甘油，5%、10%二甲亚砜。

1.1.4 安瓿管

聚丙烯吸管安瓿管。

1.2 方法

1.2.1 冷冻方法

极速冷冻，即直接把装有菌种的安瓿管从室温放入液氮中保藏；慢速冷冻，即把装有菌种的安瓿管先在液氮罐口预冷，缓慢地从上往下降，大约30 min后，安瓿管温度降至－40℃时，再把安瓿管浸入液氮。

1.2.2 解冻方法

极速解冻，即从液氮中取出的安瓿管直接放入38℃的温水中快速解冻；慢速解冻，即从液氮中取出的安瓿管放在室温条件下缓慢解冻。

1.2.3 存活率计算

经液氮保藏的菌种，取出解冻活化后移接至PDA培养基上正常培养，计算正常萌发的接种块占总移接接种块的比率。

1.2.4 出菇试验

按福建省蘑菇标准综合体中的蘑菇规范化栽培技术进行箱式种植，分析各品种的产量、质量。

2 结果与分析

2.1 不同培养基质对菌种液氮保藏存活率的影响

不同培养基质对蘑菇菌种液氮保藏存活率的影响，见表1。

结果表明，3种不同培养基存活率存在一定的差异。以PDA为培养基质的菌种，试验的2个品种以及采用不同的冷冻保护剂均可获得100%的存活。以小麦为培养基质与10%甘油冷冻保护剂组合，存活率可达98%，以小麦为培养基质与10%二甲亚砜冷冻保护剂组合，存活率只有88%～89%，以小米为培养基质与不同的冷冻保护剂组合，存活率可达94%～98%。

表1 不同培养基的液氮保藏存活率

2.2 保护剂对菌种液氮保藏的存活率影响

保护剂对蘑菇菌种液氮保藏的存活率影响见表2。

表2 冷冻保护剂对菌种液氮保藏存活率影响

结果表明，2种保护剂均以10%浓度可获得100%的存活率，在5%浓度下的存活率只有97%～98%，2种保护剂之间无明显的差异。

2.3 冻结速率对菌种液氮保藏成活率的影响

冻结速率对菌种液氮保藏成活率的影响见表3。

2个品种及不同冷冻保护剂，慢速冻结的存活率均为100%，快速冻结的存活率只有76%～84%之间，快速冻结会造成液氮保藏中菌种的大量死亡。

2.4 菌种解冻方式对液氮菌种保藏存活率的影响

菌种解冻方式对液氮菌种保藏存活率的影响见表4。2个品种的快速解冻方式，其菌种存活率均为100%，而慢速解冻方式的菌种存活率只有60%～63%，慢速解冻造成了液氮保藏中的菌种在恢复生长时大量死亡。

表3 冻结速度对液氮菌种保藏成活率的影响

表4 解冻快慢对液氮菌种保藏存活率的影响

2.5 液氮保藏菌种对栽培的产量、质量影响

液氮保藏菌种对栽培的产量、质量影响见表5。

表5 液氮保藏菌种对菌株产量、质量的影响

液氮保藏菌种和常规保藏菌种的产量、质量间均无明显差异，2个供试的不同品种表现完全一致。

3 讨论

液氮菌种保藏的关键因素之一是选择合适的冷冻保护剂，液氮保藏中使用保护剂是防止菌丝中的水成为冰晶，减少细胞膜受损，其一般分为2种类型：一类是进入细胞内，如甘油、二甲亚砜；另一类是细胞外的，大部分是大分子的物质，如聚乙烯吡咯酮、淀粉、蛋白质等。在真菌保藏中主要是使用进入细胞内的冷冻保护剂，如甘油、二甲亚砜。在本文的液氮保藏的对比试验中，2种保护剂效果没有明显的差异。由于二甲亚砜具有强烈的挥发性气体特性，操作过程中会造成空气污染及人体伤害，因此甘油更适合作为双孢蘑菇液氮保藏中的冷冻剂。

真菌的液氮保藏的冻结速度直接影响菌株的存活率。冻结方法主要分为2种，即快速冻结和慢速冻结。快速冻结即把菌种直接从室温进入液氮中，这样温度变化大约有200℃·min－1～300℃·min－1， 而慢速冻结是先控制降温速度，以 1℃·min－1～2℃·min－1的降温速度进行降温， 从室温降至－40℃左右，然后再进入液氮罐中。大部分真菌的液氮保藏菌种试验均显示出慢冻结可获得较高的存活率[4，5]，与本文实验结果相符，这主要是由于降温速度过快，细胞内形成较大的冰晶而使细胞膜受损，增加菌种的死亡率。目前液氮保藏菌种均采用慢速冻结的方法进行冷冻操作。

在液氮保藏菌种的解冻过程中，细胞内的冰晶会对细胞造成伤害，从而引起菌种的死亡，为了提高菌种的存活率，采用快速解冻方式，使细胞内的冰晶快速溶解，减少冰晶对细胞膜损害的时间，并且能够使细胞内外渗透压迅速达到平衡，本文采取快速解冻的方法，菌种存活率达到100%，取得良好的效果。

液氮保藏菌种可以完整保存该菌株的栽培特性，液氮保种方式正逐步取代常规的冰箱冷藏，特别是随着杂交菌株的不断应用，由于杂种本身所特有的不稳定因素，应用常规保种易造成菌种的退化，经过多年努力的成果很快便因菌株的退化而不能继续使用。液氮保藏菌种从根本上解决了蘑菇杂交菌种保藏的难题，使优良的杂交菌株能够长期发挥作用。

[1]Hwang SW.Stability of spawn stocks of the cultivated mushroom after 26 months liquid nitrogen refrigeration[J].Mushroom Sci,1972(8):35－38.

[2]San Antonio JP.Stability of spawn stocks of the cultivated mushroom stored for nine years in liquid nitrogen (－160 to－196 C)[J].Mushroom Sci.,1978(10):103－133.

[3]Jodona MH,Roysea DJ,Jong SC.Productivity of Agaricus brunnescens stock cultures following 5－,7－,and 10－year storage periods in liquid nitrogen[J].Cryobiology,1982(19):602－606.

[4]Challen MP,Elliott TJ.Polypropylene straw ampoules for the storage of microorganisms in liquid nitrogen[J].Journal of Microbiological Methods,1986(5):11－23.

[5]陈燕妍.超低温冻结保藏担子菌[J].真菌学报，1987，6(2)：110－117.

[6]Suman BC,Jandaik CL.Preservation of culture of Agaricus bisporus(Lange)Sing.in liquid nitrogen and its effect on yield and characters of fruiting bodies[J].Indian Journal of Mycology and Plant Pathology,1991,21(1):34－37.

[7]Sobieralski K,Salwin M.Effect of spawn storage at the temperature of liquid nitrogen of four strains of field mushroom Agaricus bisporus(Lange)Imbach on its growth and pinhead setting[J].Roczniki Akademii Rolniczejw Poznaniu,2006,40(379):43－51.