丁香胃灵合剂对慢性萎缩性大鼠胃炎SS、Gas、Bax的影响

娄 华，朱耀环，李会朋，李素洁

(1.大连医科大学 2008级研究生，辽宁 大连 116044；2.大连医科大学 附属第二医院 中医科，辽宁 大连 116027；3.大连民族学院 校医室，辽宁 大连 116620)

慢性萎缩性胃炎(CAG)是临床上常见的消化系统疾病，以局限性或广泛性胃黏膜固有腺体的萎缩改变，黏膜层变薄为主要特征。其发病率、癌变率较高，现代医学缺乏理想的治疗方法，而中医药对该病进行辨证论治，在治疗上发挥了其独特的优势。丁香胃灵合剂(CWLM)在临床治疗CAG取得了良好的效果，但其作用机理仍不明确。本研究旨在观察CWLM对CAG模型大鼠生长抑素(somatostatin，SS)、胃泌素(gastrin，Gas)含量及胃黏膜Bax表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动 物

健康清洁级 Wistar 大鼠60只，雌雄各半，体重180～230 g，大连医科大学动物实验中心提供。

1.2 实验药物

丁香胃灵合剂组成：丁香、桂枝、砂仁、白芍、白术、川芎、丹参、石斛、黄芪、甘草等组成，由大连医科大学附属第二医院中药房提供。

1.3 试剂及仪器

试剂：氨水含NH325%～28%(沈阳新兴试剂厂)；水杨酸钠(天津市化学一厂)；兔抗鼠Bax多抗(北京博奥森生物技术公司)；SS与Gas ELISA试剂盒(北京博奥森生物技术公司)；SP试剂盒(美国ZYMED公司)；DAB染色液(美国ZYMED公司)。

仪器：高速离心机HHR21型，北京医用离心机厂；电热恒温水浴箱HWS-20型，江苏太仓市实验设备厂；酶标仪Thermo 354型，美国；光学显微镜Olympus BX-51型，日本。

1.4 方 法

1.4.1 分组：将60只健康Wistar大鼠随机分为5组，即正常组、CAG组、CWLM低剂量组、CWLM中剂量组、CWLM高剂量组，每组12 只。除正常组外各组大鼠采用浓度为2%水杨酸钠溶液按1 mL/100 g灌胃2个月，1次/d，灌胃前后1 h禁食禁水，并自由饮用0.05%的氨水，2 d足量喂食，1 d停食；正常组给予1 mL/100 g体重生理盐水日1次灌胃，自由饮水进食，直至实验结束。造模过程中CAG组死亡1只，CWLM低剂量组、CWLM中剂量组各死亡1只，正常组没有死亡。随机抽取2只大鼠做胃黏膜病理组织学检查，确认造模成功后进行药物干预实验，CWLM低剂量2 g生药/ (kg·d )灌胃，相当于人的临床用量，1次/d；CWLM中剂量组4 g生药/ (kg·d)灌胃，相当于人临床用量的2倍，1次/d；CWLM高剂量组8 g生药/ (kg·d )灌胃，相当于人临床用量的4倍，1次/d；CAG组予1 mL /100 g体重生理盐水1次/d灌胃。各组灌胃均50 d后，处死所有大鼠。

1.4.2 标本中Gas、SS含量的测定：采用摘取眼球法取血，约5 mL/只，离心10 min，留取血清，采用ELISA法按试剂说明书检测Gas、SS含量。

1.4.3 大鼠组织细胞凋亡相关蛋白Bax表达的检测：操作包括两部分：①剖胃取材后,用10%福尔马林固定，按照常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片；取切片拷至已用多聚赖氨酸防脱片处理的载玻片上，进行常规免疫组织化学染色(按SABC试剂盒说明书的步骤操作，每次实验以PBS代替一抗作阴性对照)。②在光镜下进行观察，每张切片至少观察5个视野，以细胞质或细胞核中出现均匀一致的棕褐色颗粒为阳性细胞。阴性表达：未见棕黄色染色的细胞；运用计算机图像分析仪定量分析大鼠胃黏膜Bax蛋白表达的灰度值，在400倍光镜下，测定阳性细胞灰度。灰度值是反映透光密度的定量指标，其值越高，相应的蛋白表达量越少；反之则表示蛋白表达越多。计算出平均灰度值，即阳性部位灰度值与检测面积之比。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 血清Gas与SS含量的变化

与正常组比较,CAG组血清Gas和SS含量分别降低和升高，差异均有显著性意义(P<0.01)；与CAG组比较，CWLM各治疗组Gas和SS含量分别有所升高和降低，其中低剂量组Gas虽升高,但差异无显著性意义(P>0.05),且仍显著低于正常组；中剂量组Gas升高，差异有显著性意义(P<0.05);而高剂量组Gas显著升高(P<0.01),并接近正常组(P>0.05);各治疗组间相比，差异无显著性意义(P>0.05)。与CAG组比较，CWLM各治疗组SS含量不同程度的降低, 差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01),而低剂量组仍显著高于正常组(P<0.01),各治疗组间比较, 高剂量组明显高于低剂量组，差异有显著性意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清Gas和SS含量的变化

2.2 胃黏膜Bax表达的变化

大鼠胃黏膜中Bax的平均灰度值在CAG组、CWLM低、中、高各剂量组及正常组各组中的表达呈递减趋势，即相应Bax的表达呈递增趋势。与CAG组比较，CWLM低、中、高剂量组Bax的平均灰度值明显降低，差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01)，低剂量组与正常组比较，差异有显著性意义(P<0.05)。各治疗组间相比，差异无显著性意义(P>0.05)，见图1～5及表2。

图1 CAG组Bax表达(×400)

图2 正常组Bax表达(×400)

图3 CWLM低剂量组 Bax表达(×400)

图4 CWLM中剂量组Bax表达(×400)

图5 CWLM高剂量组Bax表达(×400)

表2 各组大鼠胃粘膜Bax表达的变化

3 讨 论

CAG由多种因素如饮食不节、情志失调等导致脾胃虚弱，久则气滞血瘀，气血不能荣养胃络，胃膜失养，逐渐萎缩，最终形成CAG繁杂的病理改变。本课题组以益气健脾和胃，活血化瘀之法组方丁香胃灵合剂治疗本病，方中以丁香为主药，取其温中降逆、散寒止痛之效，黄芪补脾胃之气，扶正固本，使脾气健运，气血化生有源，白术扶植脾胃，散寒除弊，消食除痞，白芍养血柔肝，缓急止痛，使肝气不犯脾胃。丹参、川芎联用增强活血行气化瘀之效，石斛养胃生津，使胃阴得充，诸药合用可使补中有消，补而不滞，共奏健脾益气、活血化瘀、和胃理气、阴阳和合之效。前期研究已证实CWLM可能通过改善胃黏膜微循环、调节胃肠蠕动和分泌功能、增强免疫力等综合作用来发挥对CAG的治疗作用[1]。

有研究表明CAG癌前病变中存在着胃黏膜营养因子(如Gas)、胃肠激素(如SS等)分泌失调[2]、细胞凋亡异常(如Bax减少等)等因子的异常表达。Gas是由胃及十二指肠G细胞合成、分泌的胃肠道多肽激素,其既能刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌,又能通过增加其DNA、RNA及蛋白的合成来刺激胃黏膜细胞的生长,增加胃黏膜血流量，从而发挥营养胃黏膜的功能。CAG患者随着胃窦萎缩的不断加重，G细胞数量不断减少，Gas的含量随之下降[3]。胃肠激素中的SS作为人体内重要的炎症负性调节肽之一[4]，主要通过旁分泌、自分泌等不同途径发挥作用。正常情况下，SS不但能抑制胃酸和胃蛋白酶分泌,而且能与Gas组成Gas-SS-胃酸分泌轴，维持胃肠的正常生理功能[5]。CAG大鼠胃黏膜中SS的含量显著高于正常组织[6]，SS的异常表达可导致组织细胞生长调节失控,最终形成肿瘤[7]。本实验结果显示：CAG大鼠血清Gas含量下降，而血清SS含量明显升高。经丁香胃灵合剂干预后,Gas含量升高、SS含量下降，CWLM 3种不同剂量呈不同程度的升高血清Gas含量，降低血清SS含量。结合相关文献报道[8]，CWLM可通过升高CAG大鼠血清Gas含量，降低血清SS含量，使Gas-SS-胃酸分泌轴正常发挥，促进Gas、胃酸、胃蛋白酶等分泌，纠正低酸状态,发挥其保护胃黏膜、促进腺体的再生、增加胃黏膜血流的作用。且其作用的发挥有明显剂量依赖性，本实验中高剂量组较其它治疗组升高血清Gas含量，降低血清SS含量，发挥治疗作用方面CWLM效果最佳。

Bax是Bcl-2基因家族中极重要的细胞促凋亡基因，Bax在高表达时与Bcl-2形成异源二聚体,促进细胞凋亡,低表达时可使CytC从线粒体中释放，继而激活caspase，以同源二聚体的形式存在，抵消Bcl-2基因的抑制凋亡作用而对细胞凋亡有正向调节作用[9，10]。正常生理状态下，胃黏膜上皮细胞死亡的主要形式是细胞凋亡，黏膜凭借Bax促凋亡与Bcl-2促增殖之间的平衡维持其稳定性[11]。一旦该平衡被打破，则有可能发生病变。目前已有不少文献报道从正常胃黏膜→萎缩性胃炎→肠化生→异型增生→胃癌，Bax表达逐渐减弱，同时细胞凋亡指数逐渐降低，使胃黏膜细胞受损，细胞凋亡减少，那些变异的细胞可能因为凋亡机制得不到正常启动在体内聚集，最终导致肿瘤形成[12]。本实验结果显示：由正常组→CWLM高剂量组→CWLM中剂量组→CWLM低剂量组→模型组，胃黏膜Bax阳性表达呈明显递减趋势；与CAG组比较，CWLM 3种不同剂量均能不同程度的上调Bax表达水平，使Bax与Bcl-2形成异源二聚体，或自身形成同源二聚体，积极促进细胞凋亡，从而在一定程度上促使细胞数目增减平衡，发挥控制甚至逆转CAG病理黏膜改变的作用。且CWLM在抑制CAG大鼠胃黏膜细胞的异常增殖方面呈现一定的剂量反应关系，其中高剂量组效果最明显。

CWLM可通过升高血清Gas含量、降低血清SS含量，上调Bax表达，发挥调节细胞凋亡、调节内分泌功能、修复胃黏膜损伤等作用来实现对CAG大鼠胃黏膜病理改变的修复，达到治疗CAG的目的。且CWLM在治疗CAG方面具有明显的剂量相关性，一定程度上提高药物剂量可以达到更好的治疗效果。

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