P16INK4A和生存素在宫颈鳞状细胞瘤样变和宫颈鳞癌中表达的临床意义

陶凤喜

(聊城市第三人民医院 妇产科，山东 聊城 252000)

宫颈癌是女性人群中第二大常见的恶性肿瘤，防治宫颈癌的方法就是早发现和早治疗，目前利用细胞学涂片筛查宫颈癌前病变很大程度减低了宫颈癌的发病率和致死率。然而，由于其单纯的细胞学筛查有很高的假阴性率而不能充分的检测宫颈癌前病变状态。P16INK4A基因是人们发现的一种直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的抑癌基因，生存素是凋亡抑制基因，其过度表达可以抑制内源性或外源性凋亡途径介导的细胞死亡[1]。本研究探讨用P16INK4A和生存素作为区分CIN的不同分级病变和宫颈癌(SCC)的可行性。

1 材料和方法

1.1 材 料

通过回顾性研究2005年1月～2010年5月因宫颈病变来聊城市第三人民医院行宫颈活检或手术的201例患者，年龄(57±12)岁,宫颈组织标本包括组织活检、宫颈锥形组织活检、移形带大部分环形切除标本和整个子宫全切标本，均经病理结果证实，其中包括60例CIN1,21例CIN2,48例CIN3和72例SCC。CIN 1～3级为宫颈不典型增生，CIN 1 级细胞异型性轻，异型细胞仅占上皮层的下1/3；CIN 2级细胞异型性明显，异型细胞限于上皮层的下2/3；CIN 3级细胞异型性显著，异型细胞几乎累及或全部累及上皮层。同期收治正常的宫颈组织10例作为对照组。

1.2 免疫组织化学方法

所有宫颈组织标本经10%中性甲醛溶液固定后常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)进行免疫组织化学染色。鼠抗人p16蛋白单克隆抗体/鼠抗人生存素单克隆抗体、SP工作试剂盒购自上海尚宝生物科技有限公司。3，3-二氨基联苯胺盐酸盐(Diaminobenzidin，DAB)显色试剂盒购自上海玉博生物科技有限公司。实验步骤按试剂盒说明书进行。

1.3 结果判定

在光学显微镜下对涂片染色情况进行评估。P16INK4A光镜下阳性物质位于细胞核内，亦可在胞质，以细胞核染成棕色或棕黄色为阳性。在目标区随即选5个高倍镜计数视野内阳性细胞占细胞总数的百分比，<5%者为阴性表达， >5%而<50%为局灶或分散的阳性， >50%为弥散阳性[2]。所有结果均与病人的活检标本或手术切除标本病理诊断相对照。生存素反应性判读：生存素的表达依靠染色强度分为2种类型：阴性：没有染色细胞或分散的弱染色细胞；阳性：分散的中等强度染色细胞或所有细胞重度染色且分布于整个视野。

1.4 统计学方法

统计学处理采用χ2检验；Spearman等级相关分析做相关性检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 P16INK4A的表达

P16INK4A在所有正常的宫颈组织中未染色；CIN病变邻近正常组织也没有表达P16INK4A，P16INK4A在CIN1、CIN2、CIN3及SCC表达分别为25.0%、42.9%、85.8%、97.2%；见表1。P16INK4A在CIN3中的表达见图1，阳性细胞占细胞总数的百分比>50%。P16INK4A表达与CIN病变分级程度具有正相关性(r=0.478,P<0.05)。

表1 P16INK4A和生存素在正常宫颈组织、CIN不同病变阶段及SCC的表达情况

图1 P16INK4A在CIN3中染色表达(×100)

2.2 生存素的表达

生存素在CIN1、CIN2、CIN3、SCC表达分别为56.7%、33.3%、67.5%及97.2%，见表1。其中在CIN3和SCC表达差异有显著性意义(P<0.05)。生存素在CIN3中染色表达见图2,分散的中等强度染色细胞或所有细胞重度染色且分布于整个视野。

图2 生存素在CIN3中染色表达(×100)

3 讨 论

研究证明，宫颈癌的发生、发展与高危型HPV感染(HPV16、18)直接相关。P16INK4A反映HPV感染的类型，是预测CIN病变结局的合适的标记。P16INK4A基因是在人染色体9p21发现的第一个直接参与细胞周期调控的抑癌基因,p16蛋白可与细胞周期素d竞争结合细胞周期依赖性激酶(cdk4)，使cdk4失活，从而阻止rb的磷酸化，去磷酸化的rb以活性形式结合e2f及atf2等转录因子，阻止细胞从G1期进入S期[3]。HPV16 癌基因产物E7 蛋白使Rb 失活从而导致转录因子E2F活性升高，CDK-Rb-E2F 调控途径被阻断,导致抑癌基因INK4产物P16INK4A大量积累和高表达。在瑞典对HPV感染的五年随访研究发现HPV16和HPV18是导致CIN2或CIN3的最大潜在病变的危险因素[4]。

本文研究显示，P16INK4A随着CIN病变分级升高，阳性表达明显增加，与CIN病变分级程度具有相关性(r=0.478,P<0.05)。在97.2%SCC病变中过度表达，进一步证实HPV感染和宫颈癌之间的因果关系密切。然而，少数宫颈癌患者不表达P16INK4A。Nieh等[5]研究显示一定比例宫颈癌患者即没有HPV感染也没有P16INK4A的表达，对于在SCC病变中P16INK4A缺失表达可能解释为P16INK4A启动子甲基化导致P16INK4A基因沉默不表达。同时，本文研究显示所有正常宫颈鳞状上皮细胞弱生存素染色，在CIN3与SCC病变中阳性表达例数差异有显著性意义(P<0.05)，可作为鉴别宫颈病变程度的指标之一。Branca等[6]研究发现当活检组织CIN为持续阴性时，生存素过度表达是存在CIN的特异性指标。

利用P16INK4A染色表达强度与CIN病变分级具有正相关性，生存素能用于区分CIN和SCC，因此在临床诊断困难的情况下，可联合检测P16INK4A和生存素作为诊断CIN病变分级及SCC的辅助指标之一。

参考文献：

[1] Grossman D，Kim PJ，Blanc-Brude OP，et al.Transgenic expression of survivin in keratinocytes counteracts UVB-induced apoptosis and cooperates with loss of p53[J].J Clin Invest，2001，108(7):991-999.

[2] Redman R，Rufforny I，Liu C，et al.The utility of p16(Ink4a)in discriminating between cervical intraepithelial neoplasia 1 and nonneoplastic equivocal lesions of the cervix[J].Arch Pathol Lab Med，2008，132:795-799.

[3] Khoo CM,Carrasco DR,Bosenberg MW,et al.INK4a/Arf tumor suppressor does not modulate the degenerative conditions or tumor spectrum of the telomerase-deficient mouse[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(10):3931-3936.

[4] Schlecht NF，Kulaga S，Robitaille J，et al.Persistent human papillomavirus infection as a predictor of cervical intraepithelial neoplasia[J].JAMA，2001，286(24):3106-3114.

[5] Nieh S，Chen SF，Chu TY，et al.Is p16INK4Aexpression more useful than human papillomavirus test to determine the outcome of atypical squamous cells of undetermined significance-categorized Pap smear? A comparative analysis using abnormal cervical smears with follow-up biopsies[J].Gynecol Oncol，2005，97(1):35-40.

[6] Branca M，Ciotti M，Santini D， et al.p16INK4Aexpression is related to grade of cin and high-risk human papillomavirus but does not predict virus clearance after conization or disease outcome[J].Int J Gynecol Pathol，2004，23(4):354-365.