11，12-EET心脏保护过程中NOS及ERK的交互作用

王 珏 闫 丽 曾翔俊 王红霞 芦玲巧 张立克

(1.首都医科大学基础医学院病理教研室，北京 100069;2.首都医科大学附属北京佑安医院肝病研究所，北京 100069;3.首都医科大学基础医学院病理生理学教研室，北京 100069)

心脏保护(cardioprotection)是指防止与急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)和再灌注(reperfusion)有关的损伤，上述损伤的主要临床表现是心肌坏死、心律失常和心肌收缩功能障碍［1］。心脏保护机制的探讨将为临床防治再灌注损伤提供新的思路，故得到重视。近年研究［2］证实，内源性生物活性物质参与心脏保护作用，其中细胞色素P450表氧化酶/环-二十碳三烯酸(cytochromeP450 epoxygenases/epoxyeicosatrienoic acids，CYP450/EETs)系统的作用近期引起关注。研究表明，11，12-环氧二十碳三烯酸(11，12-epoxyeicosatrienoic acid，EETs)减少应激心肌细胞线粒体损伤［3］及缺血后心电图异常［4］;CYP450亚型CYP2J2高表达及EETs的增加可以改善缺血再灌注心肌损伤［5］;缺血后处置通过上调 CYP2J3及11，12-EET 保护心脏［6］;故外源性 11，12-EET 具有潜在的临床应用前景。本课题组前期工作显示，11，12-EET激活血小板一氧化氮/一氧化氮合酶(nitric oxide/nitric oxide synthase，NO/NOS)系统［7］;外源性 11，12-EET改善缺血再灌注损伤的同时，出现结构型一氧化氮合酶(structural nitric oxide synthase，sNOS)增加［8-9］及细胞外调节蛋白激酶(excelluar signal regulated kinase，ERK1/2)表达增加［10］;而 ERK1/2 抑制剂阻断11，12-EET心脏保护作用［11］。鉴于NOS同功酶改变与 ERK1/2 磷酸化有关［12］，11，12-EET 引起的sNOS上调是否与ERK1/2改变有关值得探讨。本实验采用ERK1/2抑制剂PD098059，探讨11，12-EET心脏保护中sNOS与ERK的关系。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

11，12-EET(E5641，美国 Sigma公司);NOS测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);PD98059(P215，美国Sigma公司)。超速低温离心机(3K30，美国Sigma公司);PC-lab生物信号采集系统(北京Pc-lab公司);DIAX900匀浆仪(德国Aeidolph公司)。

1.2 动物模型制备

体质量200～300 g雄性Wistar大鼠，由首都医科大学实验动物部提供，动物合格证号 SCSK(京)200020012。对Wistar大鼠行戊巴比妥钠(45 mg/kg，ip)麻醉，人工呼吸机维持正压呼吸，在近主动脉根部结扎冠状动脉左前肢60 min，松开30 min，复制缺血/再灌注心肌损伤模型。

1.3 实验分组

动物分为4组，每组6只。① 缺血再灌注组(ischemia/reperfusion，I/R):给予上述同体积的0.9%氯化钠注射液20 min后复制心肌缺血/再灌注损伤模型;② 假手术组(Sham):给予上述同体积的0.9%氯化钠注射液后观察110 min;③11，12-EET缺血再灌注组(EET+I/R)，给予 6.24 × 10-8mol/L 11，12-EET，20 min后复制心肌缺血/再灌注损伤模型;④11，12-EET缺血再灌注加PD098059组(EET+I/R+PD)，给予 PD098059(0.3 mg/kg)和 6.24 × 10-8mol/L 11，12-EET，20 min 后复制心肌缺血/再灌注损伤模型。上述各组大鼠均于实验结束后取其心脏。

1.4 心功能检测

经颈总动脉逆行插管至左心室，远端接压力换能器后再经PClab软件输入计算机，持续监测左心室内压力的变化情况，并由计算机直接计算出收缩期左心室内压上升的最大变化速率(+dp/dt max)和舒张期左心室内压下降的最大变化速率(-dp/dt max)。以缺血前和再灌注30 min作为观察点，各项指标均以实际观察值/缺血前值(插管后稳定5 min的正常值)×100%表示。

1.5 心肌组织NOS活性的测定

采用化学比色法测定大鼠心肌组织中NOS总量及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)含量。sNOS含量等于NOS总量与iNOS之差。

1.6 统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件进行数据处理，所有数据用均数±标准差(±s)表示。各组间计量资料的比较采用单因素方差分析，两两比较用Student-Newman-Keuls法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 大鼠缺血/再灌注损伤心功能的变化

各组动物心肌再灌注30 min时+dp/dt max详见图1。方差分析结果为F=2 427.722，P=0.000 8。I/R组+dp/dt max低于Sham组及EET+I/R组(52.19% ± 4.22% 与 92.87% ± 4.53%，P=0.000 56;52.19% ±4.22% 与87.64% ± 4.85%，P=0.000 18);EET+I/R+PD 组(29.34% ± 21.03%)低于 EET+I/R 组(P=0.000 56)。

图1 再灌注30 min大鼠心脏+dp/dt maxFig.1 The heart+dp/dtmax in rat ats reperfusion 30 min

动物心肌再灌注30 min时-dp/dt max详见图2。方差分析结果为F=747.18，P=0.000 11。I/R 组-dp/dt max低于Sham组及EET+I/R组(54.56% ±2.27%与 89.24% ± 7.48%，P=0.000 47;54.56% ±2.27%与 79.71% ±4.30%，P=0.000 19);EET+I/R+PD组低于 EET+I/R组(27.56% ±20.33% 与79.7% ±4.30%，P=0.000 78)。

图2 再灌注30 min大鼠心脏-dp/dt maxFig.2 The heart-dp/dt max in rats at 30 min

2.2 大鼠缺血/再灌注损伤心肌NOS活性的检测

动物心肌 sNOS详见图3。I/R组(0.292 1±0.074 7)U/mg低于 Sham 组(0.746 8 ±0.023 4)U/mg，P=0.000 23 及 EET+I/R 组(1.044 1 ±0.066 6)U/mg，P=0.000 11;EET+I/R 组高于 EET+I/R+PD 组(0.734 8 ±0.037 3)U/mg，P=0.000 10。

图3 大鼠心脏结构型NOS活性Fig.3 The activity of constrictive NOS in rat

3 讨论

本研究组实验证实11，12-EET引起的心脏自身保护作用中，ERK 激活［10］和 sNOS 活力改变［8］同时出现。两者在心脏保护中是平行作用还是交互作用尚不清楚。

本实验结果显示，再灌注30 min I/R组±dp/dt max均低于Sham组，提示缺血/再灌注减弱心肌收缩和舒张性;给予11，12-EET再灌注30 min时±dp/dt max高于 I/R 组(P＜0.01)，提示11，12-EET具有拮抗缺血/再灌注对心脏的损害作用。I/R组心肌sNOS低于Sham组，提示心肌缺血/再灌注引起的心功能损伤与sNOS活力抑制有关;EET+IR组sNOS高于I/R组(P＜0.01)，再灌注期心脏±dp/dt max也高于I/R组，说明11，12-EET通过增加sNOS活力改善心功能。

Wang H等［12］指出，EETs上调sNOS是通过激活丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)。本课题组前期工作也显示 11，12-EET通过激活ERK1/ERK2介导心脏保护作用［10］。而本项研究表明，EET+I/R+PD组心肌sNOS低于EET+I/R组(P＜0.01)，提示ERK抑制剂也抑制11，12-EET引起的sNOS上调，揭示11，12-EET可能通过上调ERK进而上调sNOS。鉴于EET+I/R+PD组再灌注期心脏±dp/dt max低于EET+I/R 组(P＜0.01)，提示11，12-EET心功能保护作用可能通过上调ERK进而增加sNOS的表达。

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