竹荪等4种植物提取物的抑菌效果及复配研究

满德慧，邓尚贵，唐 艳，黄 薇，沈璐璐

（浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山 316000）

食品工业中面临的最大难题之一是食品的保藏。为了防止食品的变质、腐败，延长食品的储存期，一般采用冷藏、杀菌、密封包装等手段，或在食品中添加防腐剂。目前市场上常用的防腐剂多为苯甲酸钠、山梨酸钾、亚硝酸盐等化学防腐剂，经长期研究，发现其有诱癌性、致癌性和易引起食物中毒等毒副作用[1]。为此人们开始关注寻求新的、无毒副作用的天然生物源防腐剂。已有研究表明，药食两用的竹荪、地肤子、鱼腥草和藜蒿等4种植物具有一定的抑菌作用[2-10]。本文选用竹荪Dictyophora indusiata、地肤子Kochia scoparia和鱼腥草Houttuynia cordata和藜蒿Artemisia selengensis Turcz为原料，提取抑菌活性成分，通过对4种植物提取物的复配研究，以期制备一种健康、无毒副作用、广谱型天然生物防腐剂，为食品工业中防腐抑菌3面的研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 实验原料

竹荪：购于福建省古田县；地肤子、鱼腥草：购于浙江省舟山市某大药房；藜蒿：购于江西省南昌市。将原材料烘干、粉碎，双层保鲜袋封装置后于干燥皿中保存备用。

1.2 主要试剂和菌种

无水乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯等，试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、酵母膏、细化琼脂粉。

供试菌株：大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、沙门氏菌Salmonella sp.、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus购于中国工业微生物菌种保藏中心和中国农业科学院菌种保藏中心。

1.3 主要仪器设备

pH计（DECTA320A/C），梅特勒托利多公司；超净工作台（SW-CJ-1F）,苏州净化设备有限公司；压力蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-30522），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；水浴恒温振荡器（SHA-B），江苏金坛市亿通电子有限公司；空气恒温振荡器（THZ-C），太仓市科教器材厂；数显恒温水浴锅（SHY-3），上海博讯实业有限公司；奥林巴斯生物显微镜（YS100），日本奥林巴斯公司；电子天平（BS110），北京赛多利斯天平有限公司；恒温恒湿培养箱（HWS-270），宁波东南仪器制造有限公司；紫外可见分光光度计（U-2800），日本日立公司；高速冷冻离心机（CR21G），日本日立公司；涡旋震荡混合器（VSRTEX-6），海门市其林贝尔仪器制造有限公司；数码相机（A610）,日本佳能公司；优普超纯水机（UPK-Ⅱ-660L），上海优普纯水仪器设备有限公司；牛津杯购于北京先驱威锋生物耗材有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 样品处理

分别称取竹荪、地肤子、鱼腥草和藜蒿干粉各5 g，装入250 mL三角瓶中，加200 mL 95%乙醇，浸泡，60℃水浴恒温水浴中浸提3次，每次2 h，4 000 r/min离心10 min过滤，减压浓缩为5 mL（以原料质量计，含量相当于1.0 g/mL）。

1.4.2 抑菌测定方法

用牛津杯双层平板法[11]测定竹荪、地肤子、鱼腥草和藜蒿提取原液的抑菌谱，具体操作过程为牛津杯双层平板法检测平板的制备：在无菌培养皿中倒入10 mL加热融化的2%灭菌琼脂，待其充分冷却凝固后，放入已灭菌的牛津杯数个，并按一定次序排放整齐。将分装于大试管中的15 mL固体检测培养基融化后冷却至50℃左右，加入107CFU/mL指示菌液1 mL，涡旋混合振荡器上迅速混合均匀，倒入培养皿。培养基冷却后，用无菌镊子取出牛津杯，作为活性物质提取原液抑菌活性检测平板。将4种不同物质的提取液，用一次性移液枪头吸取100～200 μL作为待测样品，以无菌操作加入到检测平板圆孔内，37℃恒温培养箱中培养24 h，3次平行试验。观察并测定抑菌圈直径(mm)。

1.4.3 最低抑菌浓度（MIC）测定方法

根据连续稀释法[12]，将上述竹荪、地肤子、鱼腥草和藜蒿4种提取原液分别稀释成1.5、1.0、0.75、0.5、0.25 g/mL 5种浓度的提取液，向各培养皿内分别加入2 mL不同浓度的提取液，每个浓度作3个重复。然后每皿倒入20 mL已溶化的固体培养基充分混匀，每皿加入0.2 mL菌悬液涂匀，37℃恒温培养箱中培养24 h，3次平行试验。观察无细菌生长的最低提取物浓度为竹荪、地肤子、鱼腥草和藜蒿提取液的最低抑菌浓度(MIC)。试验中用无菌水作空白对照。

1.4.4 最佳复配比优化方法

根据竹荪、地肤子、鱼腥草和藜蒿4种植物提取液浓度进行L9(34)正交试验设计，以大肠杆菌抑菌圈直径为考察指标，得到对大肠杆菌抑菌效果较好的复配比。

1.4.5 数据分析方法

采用SPSS12.0软件进行数据分析。

2 结果

2.1 4 种提取物对5种供试菌的抑菌活性

采用100%浓度母液分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌进行抑菌实验，结果见表1，表1结果表明提取液对5种菌种均有较好的抑制作用。藜蒿对副溶血性弧菌的抑制效果最为突出，抑菌圈直径达到26.50 mm，明显高于对其他4种细菌的抑制作用；鱼腥草对大肠杆菌的抑菌效果也比较明显，抑菌圈直径达到22.05 mm，高于对其他4种细菌的抑制作用；竹荪对副溶血性弧菌的抑菌圈直径达到21.75 mm，抑菌效果比其他4种菌好；地肤子对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌5种菌抑制效果均低于其他3种提物，对大肠杆菌的抑菌圈最大，仅为15.00 mm。

表1 提取原液抑菌圈直径Tab.1 Antibacterial circle diameter of extraction stoste

2.2 4 种提取物对5种供试菌的最低抑菌浓度（MIC）

由表2～5可知，竹荪、地肤子、鱼腥草和藜蒿提取液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌的 MIC 分别为 0.75 g/mL、1.0 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、0.75 g/mL；1.0 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、1.0 g/mL；1.0 g/mL、1.0 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、1.0 g/mL、0.75 g/mL、1.0 g/mL、1.0 g/mL、1.5 g/mL、0.75 g/mL。结果表明，竹荪和藜蒿提取液对大肠杆菌和副溶血性弧菌具有较低的抑菌浓度，地肤子和鱼腥草提取液对5种供试菌的最低抑菌浓度较竹荪和藜蒿高。

表2 竹荪提取液的MICTab.2 MIC of extraction from D.indusiata

表3 地肤子提取液的MICTab.3 MIC of extraction from K.scoparia

表4 鱼腥草提取液的MICTab.4 MIC of extraction from H.cordata

表5 藜蒿提取液的MICTab.5 MIC of extraction from A.selengensis

2.3 4 种提取物复配后对5种供试菌的抑菌活性

由表6可知，4种提取液对大肠杆菌抑菌效果作用不一，作用效果为藜蒿＞鱼腥草＞竹荪＞地肤子。分析极差结果可知，A1B2C1D3为最佳组合，即竹荪、地肤子、鱼腥草和藜蒿的复配比为：4：3：6：3，此时大肠杆菌的的抑菌圈直径达到25.36 mm。

表6 复配浸提液抑菌的正交试验表Tab.6 Orthogonal test of inhibition zone of combined plant extracts

3 结论

本文对竹荪、地肤子、鱼腥草和藜蒿4种植物，采用乙醇浸提法进行提取，用牛津杯双层平板法分析了4种提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌等5种供试菌进行了抑菌测定，结果表明：试验中的4种植物醇提液对大肠杆菌等5种供试菌有较好的抑菌效果，其中藜蒿对副溶血性弧菌的抑制效果最为突出，抑菌圈直径达到26.50 mm；鱼腥草对大肠杆菌的抑菌效果也比较明显，抑菌圈直径达到22.05 mm；竹荪对副溶血性弧菌的抑菌圈直径达到21.75 mm；地肤子对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌5种菌抑制效果均低于其他3种材料，对大肠杆菌的抑菌圈最大，仅为15.00 mm。测定竹荪、地肤子、鱼腥草和藜蒿对5种供试菌的最低抑菌浓度，其中竹荪和藜蒿醇提液对大肠杆菌和副溶血弧菌具有较低的抑菌浓度为0.75 g/mL，地肤子和鱼腥草提取液对5种供试菌的最低抑菌浓度较竹荪和藜蒿高。

通过L9(34)正交试验结果表明，4种醇提液按照4：3：6：6的比例复配后，对大肠杆菌的抑菌效果要明显强于使用单一醇提液的效果，这说明复配各成分之间存在协同作用，表明通过对多种活性成分进行复配是一种很好的加强抑菌作用的方法。

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