mitoK（ATP）介导硫化氢预处理延迟相的心肌保护效应*

李双凤 王亚平 冉 珂 唐正国 王 丹 肖艳英

近年来研究发现，通过激活线粒体ATP敏感性钾通道[mitoK（ATP）]，可引起线粒体钾离子内流，线粒体膜去极化而降低膜电位，降低钙摄取驱动力，抑制Ca2+内流，有效防止线粒体钙超载，减轻细胞缺血再灌注（I/R）损伤[1]。有报道硫化氢（H2S）能增加心肌细胞ATP敏感性钾通道[K（ATP）]的开放率，对抗缺血损伤[2]。本研究探讨硫化氢预处理的延迟相对大鼠心肌的保护作用及mitoK（ATP）对此作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠32只，级别SPF/VAF，体质量300～320 g，购自湖南斯莱景达实验动物有限公司。NaHS、伊文思蓝、氯化硝基四氮唑兰（TTC）和5-羟葵酸（5-hydroxydecanoate，5-HD）均购自美国SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 采用随机数字表法将大鼠随机分为4组，每组8只。假手术组（Sham组）：行冠状动脉穿线但不结扎；心肌缺血再灌注组（IR组）：开胸结扎左冠状动脉前降支（LAD）30 min，松解后再灌注2 h；硫化氢预处理组（HS组）：静脉注射硫化氢供体NaHS 50 μg/kg，24 h后同IR组处理；5-HD+HS组（HD组）：结扎前15 min静脉注射5-HD 5 mg/kg，其他同HS组处理。

1.2.2 缺血再灌注模型建立 大鼠经腹腔推注3%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，多导联心电监测。气管插管，动物呼吸机控制呼吸，潮气量8～10 mL/kg，频率70次/min。在心尖搏动最明显处之上一肋间隙开胸，切开心包，确认左冠状动脉圆锥支，在圆锥支之后用7-0丝线结扎LAD，立即可见左室前壁紫绀充血，心率减慢，血压一过性下降，心电图监测S-T段明显抬高，确认阻断成功。

1.2.3 检测指标 （1）心肌梗死（心梗）面积。4组各取6只大鼠于再灌注末再次阻断LAD，经颈内动脉逆向注入1%伊文思蓝2 mL行心肌染色，充分染色后迅速剪下心脏，低温生理盐水冲洗后将左心室切成厚约2 mm的切片。血供正常心肌呈蓝染，缺血心肌呈砖红或苍白。将心肌置于37℃10%TTC中水浴15 min。正常心肌呈蓝色，缺血区未梗死心肌呈红色，梗死心肌组织为白色。切片进行数码照相，采用图像分析软件Image-ProPlus 6.0分别测定蓝色、红色、白色区域面积。左心室面积（left ventricle，LV）为蓝色、红色和白色面积之和；缺血面积（area at risk，AAR）为红色和白色面积之和；梗死区面积（infarct size，IS）为白色面积。缺血面积百分比（AAR/LV）=（缺血面积/左心室面积）×100%，梗死面积百分比（IS/AAR）=（梗死面积/缺血面积）×100%。（2）心肌细胞超微结构。每组其余2只大鼠在实验结束时剪取心脏，在冠脉结扎处下0.5 cm处剪取约1 mm×1 mm×1 mm左心室组织，2.5%戊二醛固定2 h后，送湘雅医学院超微病理室，经清洗、固定、梯度脱水、包埋后，在80℃恒温箱内放置10 h聚合，修组织块，做超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅双重染色各10 min，用荷兰FEITecnaiG212型透射电镜观察心肌超微结构，并拍片。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌缺血面积与梗死面积比较 除Sham组外，各组心肌缺血面积百分比差异无统计学意义（P>0.05）；与IR组和HD组比较，HS组梗死面积百分比减少，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），IR组与HD组比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1、图1。

表1 各组心肌缺血面积及心肌梗死面积比较（%±s）

表1 各组心肌缺血面积及心肌梗死面积比较（%±s）

**P<0.01

IR组HS组HD组F 666 44.16±6.88 45.03±7.24 43.25±6.69 0.038 39.27±5.64 25.40±3.54 38.53±5.24 7.898**组比IR∶HS IR∶HD HS∶HD P 0.005 0.662 0.011统计学处理组别 n AAR/LV IS/AAR

2.2 心肌细胞超微结构 Sham组心肌超微结构正常。IR组心肌肌原纤维排列紊乱、大面积断裂、融合、消失，肌节结构不清；线粒体形态异常，排列紊乱，肿胀，消失成空泡。HS组心肌肌原纤维排列较整齐，肌节长短较一致，明带、暗带仍可见；线粒体轻度肿胀，膜较完整，少量融合形成空泡；与IR组相比，线粒体损伤程度明显减轻。HD组与IR组差异不大，见图2。

3 讨论

H2S是一种无色臭鸡蛋味气体，以气体及NaHS 2种形式存在体内。NaHS在体内可分解为Na+及HS-，HS-与体内H+结合生成H2S。H2S作为第3种气体信号分子，在心血管系统的研究价值近来倍受关注，可调节炎症反应[3]、抑制氧化应激损伤[4]、减轻细胞内钙超载[1]，并能激活细胞信号通路[5]，发挥心肌保护作用。H2S是至今发现唯一的内源性血管平滑肌细胞K(ATP)开放剂[6]。有研究表明，H2S可通过抑制Fas蛋白表达和促进Bcl-2蛋白表达使心肌细胞凋亡减少[7]。

多项研究还表明mitoK（ATP）可能是缺血预处理的共同终末途径。缺血预处理减少细胞凋亡，减轻再灌注后心律失常和心肌梗死面积，以及其他心肌保护等作用都是通过激活mitoK（ATP）实现的。Johansen等[8]报道，mitoK（ATP）阻断药5-羟基癸酸甘油酯能完全拮抗H2S预处理对离体大鼠心脏的保护作用，表明激活mitoK（ATP）能缩小心肌梗死面积，在细胞缺血、缺氧时起保护作用。本研究通过给予钾通道阻断剂5-HD，提示与HS组相比，HD组心肌梗死面积明显增加，心肌细胞超微结构线粒体损伤明显加重，说明H2S开放mitoK（ATP）的作用被阻滞，其抗缺血再灌注性心肌损伤作用被削弱。

结合相关研究[9-11]，H2S心肌保护作用的可能机制为：（1）腺苷二磷酸（ADP）一般通过线粒体内膜表面的肌酸激酶和腺苷酸载体之间的功能耦联部位进入线粒体膜，钾离子内流引起的线粒体基质容积增加可对这一功能耦联产生保护作用，导致ADP不能进入线粒体，线粒体只能磷酸化肌酸，通过减少线粒体ATP的消耗来减轻细胞能量代谢。（2）调节线粒体基质容积：线粒体是生物能量代谢的重要场所，其基质容积的改变直接影响能量代谢状态。缺血缺氧时线粒体基质减少，引起膜间腔扩张，使该部位结构紊乱、内膜成分释放或消除。钾离子通道打开促进钾离子内流，由此线粒体基质容积增加，激活电子传递链，促进线粒体呼吸和ATP合成增加。同时伴随其他离子的进入，达到渗透压和电位平衡。此过程伴有水分的进入，从而引起基质容量的增加，对抗基质减少及其所引起的呼吸抑制。（3）钾离子通道的开放，使钾离子内流进入线粒体，降低了内膜电位差，减小了钙离子内流动力。同时，钾离子通道的开放使部分钙离子从线粒体进入胞质，减轻了线粒体钙超载，增加了胞浆内的钙离子浓度，引起蛋白激酶C激活，从而对心肌产生预处理保护。

综上所述，H2S预处理延迟相能够减轻在体大鼠心脏缺血/再灌注损伤，且这种保护作用与其开放线粒体ATP敏感性钾通道有关。但细胞损伤可能还存在其他途径。因此，如何评价硫化氢的心肌保护作用还有待进一步研究。

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