青钱柳细胞悬浮培养及三萜化合物积累

尹忠平，上官新晨，米丽雪，蒋 艳，吴少福，张月红

1)食品科学与技术国家重点试验室，南昌大学，南昌330047;2)江西省教育厅天然产物研究与开发重点实验室，江西农业大学，南昌330045

青钱柳 (Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinsk)为中国特有胡桃科青钱柳属单种属珍稀植物，其叶常用于制茶，具有降糖降压、清热解暑等功效［1］.青钱柳富含三萜类、黄酮类、多糖类及微量元素等活性成分［1-3］，是良好的天然保健食品资源，极具开发利用前景.但其有性繁殖系数低，无性繁殖困难，自然资源稀缺，严重制约其开发利用，植物细胞培养技术有望解决青钱柳资源缺稀的问题.本研究探讨了青钱柳细胞悬浮培养体系的建立及三萜化合物的积累，旨在为植物细胞培养生产三萜化合物等次生代谢产物提供借鉴.

1 实验材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

仪器采用SKY-211B全温度恒温振荡培养器(上海苏坤实业有限公司);HF-2.5B超声循环提取机 (北京弘祥隆生物技术开发有限公司).试剂有2，4-D、NAA、6-BA和KT(生化试剂，国药集团化学试剂有限公司)，熊果酸、齐墩果酸 (标准品，中国药品生物制品检定所)，其他均为分析纯.

1.2 愈伤组织的诱导及继代培养

将青钱柳无菌幼叶 (由采自江西农业大学科技园的青钱柳茎段诱导获得)剪成0.5 cm2，接种于诱导培养基上 (MS培养基+2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+质量浓度为30 g/L的蔗糖+7 g/L琼脂，pH值5.6～5.8)，在相对湿度40% ～60%、(25±2)℃下暗培养7 d，而后进行光培养(每天光照12 h，光照强度1 000～1 500 lx).选择状态较好的愈伤组织继代，激素调整为0.5 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L KT，其他培养条件同上.

1.3 细胞悬浮培养体系及动态生长曲线的建立

挑选生长旺盛的愈伤组织10 g，接种于装有100 mL液体培养基的500 mL培养瓶中，振荡悬浮培养;培养条件:MS液体培养基中加0.5 mg/L 2，4-D、0.3 mg/L NAA、1.0 mg/L KT 和质量浓度为30 g/L的蔗糖，pH=6.0，(25±1)℃，115 r/min，暗培养;多次继代初步建立悬浮细胞系.以第12天的生长量(干质量)为指标，对培养基种类、装液量、接种量、pH值、光照时间、碳源种类及浓度、激素种类及浓度7个因素进行优化.采用优化后的培养基配方及培养条件，悬浮培养16 d，每2 d测定细胞的生长量，建立细胞培养动态生长曲线.

1.4 总三萜的提取及测定

①提取方法.准确称取500 mg青钱柳悬浮培养细胞 (愈伤组织或叶)粉末，加6 mL乙酸乙酯，超声辅助提取 (60℃，30 min)，离心，重复提取1次，合并提取液，定容至12 mL，待测;②测定方法.参照文献［3］的测定方法，以熊果酸为标准品，所得测定回归方程为y=0.004 7x－0.016 6，R2=0.997 7，其中y为吸光度值，x为熊果酸质量(单位μg);③ 换算因子的获得.称取悬浮细胞、愈伤组织和叶片精制总三萜各25 mg，甲醇定容至25 mL，进行总三萜测定.按f=m/(ρVn)计算换算因子，其中m为精制青钱柳总三萜质量 (单位mg)，ρ为测定的质量浓度 (单位mg/mL)，V为待测液体积 (单位mL)，n为稀释倍数.得f悬浮细胞=0.510 4，f愈伤组织=0.485 8，f叶=0.456 3.样品总三萜含量计算:实际含量 =测定含量 ×f.

1.5 熊果酸和齐墩果酸测定

采用高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography，HPLC)测定，检测条件:Waters C18色谱柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm);检测器Waters 2487;检测波长210 nm;流动相为甲醇和质量分数为0.1%磷酸水溶液，体积比为90∶10;流速0.85 mL/min;柱温40℃.齐墩果酸测定回归方程y=558 392x+141 378，R2=0.999 1，其中y为峰面积，x为齐墩果酸质量 (单位μg);熊果酸测定回归方程为y=509 609x+367 329，其中y为峰面积，x为熊果酸质量 (单位μg)，R2=0.998 2.

1.6 总三萜薄层层析方法

铝质高效预制薄板 (Merck公司);展开剂为石油醚、乙酸乙酯和甲醇 (体积比 30∶10∶7);LB特征显色.

1.7 悬浮培养细胞鲜、干质量的测定

鲜质量为悬浮培养细胞抽滤后质量，干质量为抽滤后悬浮细胞置于60℃烘至恒重后质量.具体参照文献［4］.

2 结果与讨论

2.1 愈伤组织诱导、继代培养及优良愈伤组织获得

无菌幼叶在暗培养的7 d里，基本无变化，转入光照培养后，开始有所萌动，10～12 d，切口边缘膨大，随后有白色愈伤组织出现;第15～20天生长迅速，如图1(a);第20～25天基本处于静止状态，而后逐渐衰老、褐化.首次继代在第20天进行，随着继代次数增加，培养周期逐步缩短，继代4～5次后缩短至15 d左右.愈伤组织呈绿色、黄褐色、红色和灰白色等色泽，并呈现疏松或致密等不同生长状态，如图1(b) ～图1(d).愈伤组织的质素是建立良好植物细胞培养体系的关键，致密和水渍状的愈伤组织难以建立起良好的悬浮培养体系，对其改良是必要的.选择绿色、较为疏松的愈伤组织继续筛选和继代培养，5～6个月后获得淡黄色、疏松、生长旺盛的优良愈伤组织，如图1(e)，其继代周期缩短为10 d，该愈伤组织适合建立悬浮培养体系.

图1 青钱柳愈伤组织生长状态Fig.1 Growth shape of Cyclocarya paliurus calli

2.2 悬浮培养细胞系的初步建立

取优良的愈伤组织进行悬浮培养，3～5 d愈伤组织散开，培养液开始变浓，5～10 d生长旺盛，10 d后逐渐衰老、褐化.初代细胞生长缓慢，呈黄褐色，数十个细胞聚集成团，细胞形态不稳定，见图2(a).随继代数增加，细胞生长速度加快，培养物渐变成浅灰色，细胞团变小，10～30个细胞的团块较多，见图2(b)和图2(c).至第10代时，生长状态稳定，培养物呈浅黄色，有一定量的单细胞呈现，4～20个细胞的团块较多，见图2(d).经过多次筛选和继代培养，初步建立了悬浮细胞系，均匀砂粒状是悬浮细胞生长良好的特征之一，Kolewe等［5］研究紫杉细胞悬浮培养时也发现了此规律.

图2 不同培养代数悬浮细胞倒置显微镜观察图 (×400)Fig.2 Suspended cells of different subculture time under inverted microscope

2.3 悬浮培养条件的优化

由于悬浮细胞对于营养成分、环境条件的变化更加敏感，培养条件的优化尤为重要.青钱柳细胞在MS、B5、WPM、DCR和DKW 5种典型培养基中生长情况基本相似，细胞生长量分别为11.11、7.38、10.84、7.95 和9.99 g/L，相对而言，MS 培养基作为基本培养基更为合适.在100 mL三角瓶中，细胞增长量随装液量的增加呈先升后降之势，如图3(a)，培养基以40 mL装瓶量为优选.接种量试验结果如图3(b)，在40 mL培养基中，青钱柳细胞悬浮培养需2 g(鲜质量)以上的接种量，3 g(鲜质量)较为合适.细胞在pH值5～7范围内都能较好生长，相对而言，pH值5.0～6.0更为合适，如图3(c).细胞在暗培养、每天12 h光照培养和每天24 h光照培养条件下均能生长，生长量分别为13.96、10.39 和11.20 g/L，即暗培养更为有利.碳源方面，以蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖和葡萄糖5种碳源培养时，细胞生长量分别为12.64、9.14、10.63、3.64 和 8.11 g/L，蔗糖更有利于细胞生长，乳糖会严重影响生长;当蔗糖质量浓度为10、20、30、40和50 g/L时，生长量分别为7.92、11.97、12.27、14.93 和10.97 g/L，40 g/L 时增量最大.激素方面，本研究采用2，4-D(0.2～3.2 mg/L，11个梯度)、NAA(0～2.0 mg/L，11个梯度)、6-BA(0～2.0 mg/L，11个梯度)和 KT(0～2.0 mg/L，11个梯度)进行组合试验，在2，4-D 0.8 mg/L、NAA 1.8 mg/L、6-BA 0.8 mg/L 和 KT 0.8 mg/L条件下细胞生长相对较好，生长量可达15.40 g/L.综上所述，青钱柳细胞悬浮培养的优化条件为:MS培养基为基本培养基，2，4-D 0.8 mg/L，NAA 1.8 mg/L，6-BA 0.8 mg/L，KT 0.8 mg/L，蔗糖质量浓度40 g/L，pH=6.0，100 mL三角瓶中装液量为40 mL，接种量为3 g(鲜质量)，暗培养.

2.4 悬浮细胞动态生长曲线的建立

图3(d)青钱柳细胞悬浮培养动态生长曲线，可分为4个时期，0～4 d为延迟期，4～8 d为快速生长期，8～10 d为静止期，10～16 d为衰老期.优化条件下生长量可达15.56 g/L，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为2.43%，第8天继代较为合适.

图3 悬浮培养条件优化实验结果及悬浮细胞动态生长曲线Fig.3 Results of optimizing experiment on suspension culture conditions and danamic growth curve of suspended cultured cells

2.5 悬浮细胞总三萜的检测分析

总三萜提取和测定结果表明，愈伤组织中总三萜质量分数相对最低，为2.37%;叶片次之，为4.21%;悬浮细胞最高，为5.98%.优化条件下悬浮培养收获细胞(干质量)19.73 g/L，总三萜产量可达1 179.85 mg/L.对比分析图4显色点的位置、数量和颜色深浅可见，悬浮细胞、愈伤组织和叶片中的三萜化合物种类基本相同(图中紫红色点)，但各三萜化合物的比例不同;叶片总三萜展开后薄板下端紫红点较浓，如图4(a)中2及图4(b)中3，可见以极性较高的三萜为主，而愈伤组织和悬浮细胞以极性较低的三萜为主，如图4(a)中1、3及图4(b)中4;愈伤组织和悬浮细胞中熊果酸和齐墩果酸的含量较高，尤其是悬浮细胞.各总三萜提取物中，叶片总三萜杂质多 (图中非紫红色点)、纯化难度大，愈伤组织总三萜杂质较少，悬浮细胞总三萜杂质最少，易于纯化.以上结果显示，青钱柳悬浮培养细胞总三萜含量高，且易于提取和纯化，可作为三萜化合物的良好来源.

图4 青钱柳叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞总三萜薄层层析图Fig.4 Thin layer chromatography pictures of total triterpenoids from Cyclocarya paliurus leaves，callus and suspended cells

2.6 悬浮细胞熊果酸和齐墩果酸的测定

HPLC检测结果如图5，发现悬浮细胞富含熊果酸和齐墩果酸，质量分数分别高达 2.25%(RSD 为1.15%)和 0.81%(RSD 为1.43%);按悬浮培养细胞收获19.73 g/L(干质量)计算，熊果酸和齐墩果酸产量分别达443.64 mg/L和159.00 mg/L.因此，青钱柳细胞悬浮培养可用于生产熊果酸和齐墩果酸.

图5 齐墩果酸、熊果酸和青钱柳悬浮细胞总三萜高效液相色谱图Fig.5 HPLC pictures of oleanolic acid，ursolic acid and total triterpenoids from suspended Cyclocarya paliurus cells

结 语

三萜类物质是一类重要的天然活性化合物，研究表明，大多数三萜化合物都具有药理活性，如抗糖尿病［6-7］、抗肿瘤［8］、抗氧化［9］、抗炎［10］和增强免疫功能［6］等.熊果酸和齐墩果酸为同分异构体，是代表性的五环三萜化合物，具有保肝护肝、降血糖、抗菌和抗HIV等多种功能活性［6-7］，在医药和保健食品领域具有重要的应用价值.目前，三萜化合物的生产基本依赖于天然植物提取，由于植物生长周期较长，易受自然条件影响，加上掠夺式的利用，可用资源急剧下降，严重制约了三萜类物质的开发和应用.植物细胞培养周期短、不受自然条件限制、重复性好且易于工业化生产［4-5］，是解决植物资源短缺、生产次生代谢产物的良好途径，已有不少研究报道，如 Boonsnongcheep等［11］以野葛细胞悬浮培养生产类异黄酮;Estrada-Zúňiga 等［12］以醉鱼草细胞培养生产苯丙素类化合物;Yang等［13］以胀果甘草细胞培养生产黄酮化合物.以人参细胞培养生产皂甙、洋地黄细胞培养生产生物碱、长春花细胞培养生产抗癌生物碱等已达到中试或工业化生产水平［4］.经检索，迄今尚未见以青钱柳细胞悬浮培养生产三萜化合物的相关报道.本研究结果表明，青钱柳细胞悬浮培养总三萜产量达1 179.85 mg/L，熊果酸和齐墩果酸产量分别达443.64 mg/L和159.00 mg/L，可用于熊果酸和齐墩果酸的生产，具有广阔应用前景.

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