RP-HPLC法测定胆宁片中金丝桃苷的含量

黄媛平

(南昌市第三医院 药剂科,江西 南昌 330009)

胆宁片[1]由大黄、虎杖、青皮、陈皮、白茅根 、郁金、山楂七味药组成,方中山楂具有开胃消食、化滞消积、活血散瘀、化痰行气;山楂含有黄酮类、有机酸类、三萜酸类活性物质,近年来的药理研究证明山楂黄酮对心血管系统等有多方面的药理作用[2],金丝桃苷和芦丁是山楂黄酮的代表成分,有关山楂单味药金丝桃苷的含量测定的报道较多[3-4],但未见报道胆宁片中金丝桃苷含量测定的HPLC方法。为控制其内在质量,本研究中笔者建立了RP-HPLC法测定金丝桃苷含量的方法,本方法准确、精密、重现性好。

1 仪器与试药

Agilent 1200液相色谱仪(美国),包括:四元梯度泵、在线脱气机、柱温箱、G1314B VWD紫外检测器;Sartorius BS124S千分之一电子分析天平和Sartorius BT25S十万分之一电子分析天平;KQ-250VDB型双频数显超声机(昆山市超声仪器有限公司),PHS-3C精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)。

金丝桃苷(批号:111521-201004)购自中国药品生物制品检定所;乙腈(色谱级),流动相用水为双蒸水(自制);其余试剂均为分析纯。胆宁片(市售),大黄(20100910)、虎杖(20090915)、青皮(20100713)、陈皮(20101014)、白茅根(20101205)、郁金(20090712)、山楂(20101116)。药材均购自黄庆仁大药房,由中药鉴定教研室鉴定符合2010版《中国药典》规定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱 Venusil XBP-C18柱(4.6mm ×250mm,5μ m);流动相为乙腈-0.05%甲酸水(三乙胺调节调pH至5.0),梯度洗脱(流动相梯度设置见表1);柱温为25℃;检测波长:358nm,进样品量均为 20μ L。

表1 流动相梯度

2.2 混合对照品溶液的配制

取金丝桃苷对照品适量,精密称定,置容量瓶中,加甲醇配制成1mL含132.62μ g金丝桃苷对照品溶液母液。

2.3 供试品溶液的制备

取胆宁片10片,除去包衣,60℃干燥恒重,粉碎磨成粉末,过100目筛。称取约0.1g,精确称定,置10mL容量瓶中,加 70%甲醇 7mL,超声提取 45min。冷却至室温,用70%甲醇定容置刻度,摇匀,0.45μ m微孔滤膜滤过,即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

按胆宁片处方比例和制备工艺分别制备不含山楂的胆宁片,并按供试品溶液的制备方法制备得到阴性对照溶液,按色谱条件测定,结果阴性对照样品对测定无干扰,理论塔板数按金丝桃苷计不低于9000,见图1。

图1 对照品(S1)、供试品(S2)和缺山楂阴性样品

2.5 测定方法

分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液,按上述色谱条件测定,采用外标法计算即得。

2.6 线性关系考察

分别准确吸取按“2.2”项下方法制备的混合对照品母液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL 置 1mL 容量瓶中,甲醇定容,摇匀,即得6种不同浓度的混合对照品溶液。分别吸取上述浓度对照品溶液20μ L,注入色谱仪,记录色谱图。以峰面积(Y)对浓度(X,μ g◦mL-1)进行线性回归,得回归方程Y=17229X-9983,r=0.9996(n=6),线性范围:13.26～132.62μ g◦mL-1。

2.7 精密度试验

精密吸取“2.6”项中间浓度梯度点的混合对照品溶液20μ L,重复进样6次,按色谱条件测定峰面积值。求得金丝桃苷RSD值为0.96%。

2.8 稳定性试验

取同一份供试品溶液,分别于 0 、2、4 、6、8 、10 、12h,按上述色谱条件测定峰面积。结果表明:供试品溶液在12h内,色谱峰面积无明显变化,金丝桃苷RSD值为1.26%,说明供试品溶液在制备后至少12h内稳定。

2.9 重复性试验

取同一批样品6份(批号:20100404),按供试品溶液制备方法制备,依法测定,计算物质含量。结果金丝桃苷的平均含量分别为:7.36mg◦g-1,其 RSD值为:1.43%。

2.10 加样回收率试验

取已知含量的供试品粉末6份,每份重约0.05g(含金丝桃苷7.45mg◦g-1),精密称定,置10mL容量瓶中,分别精密加入浓度为 371.5μ g◦mL-1的金丝桃苷标准品溶液1.0mL,按供试品溶液制备方法制备,按色谱条件测定,计算平均回收率,结果金丝桃苷平均回收率为98.13%(n=6);RSD为1.41%。

2.11 样品含量测定

取3批胆宁片样品,按“2.3”项下方法制备样品溶液,按色谱条件测定,采用外标法计算含量,结果见表2。

表2 胆宁片中金丝桃苷的含量测定结果 (n=3)

3 讨论

金丝桃苷为黄酮醇苷类化合物,在260nm及360nm下有最大吸收,本实验选择358nm为检测波长,以尽可能地排除胆宁片中其他杂质的干扰,得到的金丝桃苷色谱峰与其他杂质峰分离度良好。

为了尽可能将胆宁片中的金丝桃苷提取完全,本实验对样品前处理条件进行了考察,包括提取溶媒(水、50%甲醇、70%甲醇 、90%甲醇 、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇)和提取方法(超声和回流),结果表明:以70%甲醇10mL,超声提取30min可以将所取样品中的金丝桃苷提取完全。

本实验考察了各种比例以乙腈:水,甲醇:水,乙腈缓冲液和甲醇甲酸缓冲液洗脱系统,结果表明:乙腈-0.05%甲酸缓冲液(用三乙胺调pH至5.0),目标成分色谱峰于邻近的峰能达到基线分离,峰形较好,理论塔板数高,分离效果最好。此外发现柱温在25℃时比30℃的分离效果更好。

[1] 国家药典委员会.中国药典[M].北京:化学工业出版社,2010:540.

[2] 郑虎占,董泽宏,佘靖,等.中药现代研究与应用[M].北京:学苑出版社,1997:597.

[3] 陈宝龙,黄琦,郑朝华,等.高效液相色谱法测定山楂中金丝桃苷的含量[J].中国实验方剂学杂志,2008,14(3):24-26.

[4] 马国,蒋学华,黄婷,等.HPLC同时测定山楂叶提取物中的5种主要成分[J].华西药学杂志,2007,22(5):547-549.