N+离子注入诱变筛选胸腺嘧啶缺陷型大肠杆菌

2011-07-25 07:25昌国强丁庆豹郑之明袁成凌
化学与生物工程 2011年4期
关键词:离子注入培养皿存活率

昌国强,欧 伶,丁庆豹,郑之明,王 丽,袁成凌

(1.华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237;2.中国科学院等离子体物理研究所 离子束生物工程学重点实验室,安徽 合肥 230031)

营养缺陷型菌株在工业微生物的设计育种、遗传学及医学等领域有着重要作用[1]。不同的研究及实际应用常常需要获得某种特定营养缺陷型的突变株,然而特定营养缺陷型菌株的筛选十分困难,需要经过复杂的物理和化学诱变才能获得。

离子束注入技术是20世纪80 年代中期研究出来的一种诱变技术[2]。与其它诱变源相比,离子束注入诱变可以在轻度损伤的情况下,获得更高的突变率(较其它诱变高出1~2个数量级)和更广的突变谱,因此被广泛运用于各种生物细胞诱变选育的研究。

大肠杆菌(Escherichiacoli)的胸苷酸(dTMP)代谢途径[3]有两条:第一条为从头合成途径,即尿苷酸(UMP)经过一系列的代谢途径,最后形成脱氧尿苷单磷酸(dUMP),在胸苷酸合成酶(TS)的作用下生成脱氧胸苷单磷酸;另一条为补救途径,可以直接从体外吸收胸腺嘧啶或者胸腺嘧啶核苷来合成胸苷酸。

作者在此采用低能离子束注入法诱变大肠杆菌,并利用甲氧苄啶(TMP)[4]定向筛选,获得胸腺嘧啶(T)营养缺陷型的大肠杆菌突变菌株,再克隆出T营养缺陷型菌株TS基因[5],通过基因重组技术构建T-重组子,并测定其TS基因序列,与正常大肠杆菌的TS基因进行对比,以鉴定突变株TS基因是否发生突变。

1 实验

1.1 菌种、质粒和培养基

E.coliDH5α,自行保存。

pMD-18T 载体,TAKARA生物技术公司;E.coliBL21(DE3),Novagen。

LB液体培养基:蛋白胨10 g·L-1,酵母提取物5 g·L-1,NaCl 10 g·L-1,根据需要另加入终浓度100 μg· mL-1羧苄青霉素钠或50 μg· mL-1卡那霉素,固体培养时另加入17 g·L-1琼脂。

GS培养基:(NH4)2HPO42.5 g·L-1,KH2PO41.5 g·L-1,NaCl 5.0 g·L-1,MgSO4·7H2O (20%溶液)0.5 mL·L-1,谷氨酸钠 3.0 g·L-1,葡萄糖3.0 g·L-1。

GST培养基:(NH4)2HPO42.5 g·L-1,KH2PO41.5 g·L-1,NaCl 5.0 g·L-1,MgSO4·7H2O (20%溶液)0.5 mL·L-1,谷氨酸钠 3.0 g·L-1,葡萄糖 3.0 g·L-1,胸腺嘧啶50 μg·mL-1。

1.2 试剂与仪器

DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶、T4连接酶,TAKARA生物技术公司;DNA回收试剂盒,天根生物技术公司;琼脂糖、标准分子量DNA (DNA Marker)、三羟甲基氨基甲烷(Tris),鼎国生物技术有限公司;低分子量标准蛋白(Protein marker),中国科学院上海生化所;胰蛋白胨、酵母粉。其它试剂均为国产分析纯。

Mini MJ型PCR仪,DYCP-31型水平电泳槽,725型紫外光栅分光光度计,DY CZ-24 D型电泳仪,GL-312型UV检测仪,JY92-Ⅱ型超声破碎仪,低能离子注入仪(中国科学院等离子体物理研究所)。

1.3 菌株的诱变

1.3.1 菌悬液的制备

将大肠杆菌BL21于LB 液体培养基中培养至对数期,浓度约为1×108cfu·mL-1。取10 mL发酵液离心得菌体,用0.01 mol·L-1的磷酸缓冲溶液(PBS)重悬。取0.1 mL 重悬菌液均匀涂布于无菌空白培养皿中,无菌风吹干或自然晾干后立即进行N+离子注入。

1.3.2 N+离子注入[6]

将上述涂菌培养皿放入离子束注入靶室进行离子注入,注入能量为10 keV,靶室真空度为0.001 Pa,以8 s脉冲式注入,间隔为5 s,单次注入剂量为2.5×1013ions·cm-2。注入剂量(×2.5×1013ions·cm-2)分别为5、10、15、20、25、30、40、60、100。注入后立即用无菌缓冲溶液将培养皿上菌体冲洗下来。

以经过真空处理而不注入离子束的菌株作为对照。

1.3.3 诱变后处理

将经离子束注入过的样品培养皿在无菌条件下用无菌PBS洗脱,收集洗脱液,经适当稀释后涂布于含胸腺嘧啶的LB培养皿,置于培养箱中于37℃培养48 h后计数,计算存活率。

1.4 菌株的筛选

1.4.1 T营养缺陷型菌株的浓缩

将经离子束注入后的培养皿用PBS洗脱,取一定体积洗脱液,接种于含T的GS 液体培养基培养一段时间,再加入一定浓度的甲氧苄啶(TMP),培养过夜,菌液离心后用PBS重悬。

1.4.2 T营养缺陷型菌株的筛选

取200 μL重悬菌液涂布于LB+T的培养皿上作为母板,置于培养箱中于37℃培养24 h,用平板影印法将母板上单菌落分别影印到GS+T+TMP培养皿及GS+TMP对照培养皿上,37℃培养24 h,将在GS+TMP培养皿上不生长、而在GS+T+TMP培养皿上生长的单菌落挑出,即为T营养缺陷型菌株。将筛选出来的T营养缺陷型菌株保存在终浓度15%的甘油储存液中并置于-80℃冰箱中保存备用。

1.4.3 T营养缺陷型菌株的鉴定

为了进一步研究T营养缺陷型菌株的生理特性,掌握营养缺陷的代谢机理,推测作为胸苷酸途径代谢的限速酶——胸苷酸合成酶基因发生突变,导致该酶失活,这可能是营养缺陷的原因。因此对该酶基因进行遗传学鉴定。

胸苷酸合成酶基因(ThyA)序列参见Genbank[7]。按文献[8]方法提取突变菌基因组,以其作为模板设计5′端引物 GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGA-AACAGTATTTAG、3′端引物 GGAATTCTTAGATAGCCACCGGCGCTTTAATG,进行PCR扩增,下划线处分别为XbaⅠ和EcoRⅠ的酶切位点。扩增条件为:95℃预变性5 min后,PCR循环:94℃变性30 s,60℃退火45 s,72℃延伸60 s,共30个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物的纯化按琼脂糖凝胶回收试剂盒说明进行。

将回收的目的基因与pMD-18T克隆载体连接,转化E.coliDH5α感受态细胞,涂布于含羧苄青霉素钠的LB平板上,过夜培养。挑单克隆菌株TPMD 1,提取质粒,进行限制性内切酶分析鉴定,如确定为阳性,进一步测定DNA序列。

1.4.4 DNA测序及序列分析

DNA测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成,双向测序,确保测序的准确性。序列分析由美国国立生物技术信息中心相应站点http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi在线完成,通过在线运行blastn和blastx,比对突变基因及其相对应的多肽序列,了解基因突变位点,并运用Discovery studio分子模拟软件考察TS蛋白在突变前后的三维结构变化,研究其TS变异后失活原因。

2 结果与讨论

2.1 N+离子注入对菌株存活率的影响(图1)

图1 N+离子注入对菌株存活率的影响

由图1可知,在N+注入剂量小于15×2.5×1013ions·cm-2时,随N+注入剂量的增加,菌株存活率迅速降低;当剂量达到15×2.5×1013ions·cm-2后,存活率有短暂的回升,后又逐渐下降,整个过程呈“马鞍型”变化曲线,注入剂量超过100×2.5×1013ions·cm-2后存活率趋于零。这可能是由于离子注入细胞的射程较短,离子束侵蚀细菌细胞表面,大量自由基在胞内堆积,破坏胞内活性大分子,使得细菌迅速死亡;但是当剂量增加到一定强度时,进入细菌体内的离子会在菌体外形成一种库仑斥力,在胞外形成保护屏障,阻碍离子靠近菌体细胞,细菌存活率开始上升;但是剂量超过一定限度,细胞又会失去保护屏障,开始慢慢死亡。因此,选择“鞍峰”位置剂量能获得最大突变率。本实验选择最佳诱变注入剂量为20×2.5×1013ions·cm-2,此时,菌株的存活率约为25%。

2.2 甲氧苄啶对突变菌筛选的影响

在筛选过程中为提高突变菌比例,需对诱变后的培养液进行适当浓缩处理。目前常用的细菌浓缩法为青霉素浓缩法[9],但该方法不能定向选育,不方便后续的筛选工作。

本实验选用针对性更强的甲氧苄啶(TMP)作为筛选试剂。四氢叶酸是胸苷酸合成酶催化dUMP生成dTMP的供甲基体,四氢叶酸的供应不足,胸苷酸合成酶就无法发挥其催化作用,胸苷酸的正常代谢途径中断,菌体无法自身合成胸苷酸,在无外源胸腺嘧啶时可导致细菌死亡。TMP的作用是能与二氢叶酸还原酶发生不可逆结合,阻止体内四氢叶酸的生成,胸苷酸正常代谢途径受TMP的抑制作用,细菌无法正常生长。而T营养缺陷型菌株则不受TMP的影响,当培养基中添加了T或者胸腺嘧啶核苷(TR)时,能摄取T或TR来合成胸苷酸,满足T营养缺陷型菌株正常的生长需求。因此,T营养缺陷型菌株在含甲氧苄啶的GST培养基中能正常生长,而野生型菌株将会受到抑制。

通过测定T营养缺陷型突变菌株在有无TMP时光密度(有TMP时为OD600′,无TMP时为OD600)的比值(OD600′/OD600),考察TMP浓度对菌株生长的影响,结果见图2。

图2 TMP浓度对突变菌生长的影响

OD600′/OD600太大,说明TMP没有起到筛选的作用;OD600′/OD600太小,说明TMP在抑制原始菌株生长的同时,也一并抑制了突变菌株。从图2可知,OD600′/OD600为0.3左右所对应的TMP浓度较佳,约为50 μg·mL-1。

2.3 PCR扩增产物及重组菌ThyA基因的检测(图3)

图3 PCR(a)及pMD-18T-ThyA(b)双酶切鉴定结果

由图3可知,突变菌与原始菌ThyA基因的PCR扩增后,回收产物琼脂糖凝胶电泳,目的基因大小为795 bp;重组克隆载体pMD-18T-ThyA双酶切后琼脂糖电泳,在800 bp和2500 bp附近都有条带出现,说明克隆质粒构建成功。

2.4 突变基因的测序及其突变位点的定位

分别测定原始菌株和突变菌株目的基因,并将测序结果与Genbank基因库的E.coliTS基因序列比对,鉴定出突变位点为第173个碱基由AT→CG,对应的氨基酸由谷氨酸(E58)突变为丙氨酸(A58)。谷氨酸为极性氨基酸,并且在同源性基因比对中发现该位点为高度保守位点,如图4所示。

图4 TS保守区域比对图

图4为TS氨基酸同源保守序列比对图,来源于NCBI蛋白质数据库;此图黑体字符为TS保守区域,带#号标记的氨基酸位点为TS氨基酸序列高度保守位点。在第二个#处为E.coliTS酶蛋白第58个氨基酸位点——酸性氨基酸谷氨酸(E58),为酶活性位点区域,在酶催化过程中提供一个良好的催化环境,并传递质子,发挥着重要作用;E58突变为A58后,酶活性局部区域的极性环境发生巨大改变,催化反应中的质子化与去质子化无法顺利进行,酶活性下降。

在软件分析过程中还发现,E58突变为A58后,E58附近的另一氨基酸活性位点苯丙氨酸(F176)的空间位置发生了变化,如图5所示。

Glu58与Phe176突变前用标记,突变后用标记

由图5可知,F176的侧链苯环基团在TS变异后明显朝着空间位置突起,占据了酶活性部位的空间,直接导致酶催化反应底物在活性区域中无法处于正确的位置,甚至阻止了底物进入到活性部位。这样TS酶活性进一步降低,甚至失去活性。

3 结论

采用低能N+离子注入诱导大肠杆菌,通过TMP定向筛选得到T营养缺陷型菌株。应用遗传学方法,鉴定出ThyA基因确实发生突变,突变位点为第173位碱基由AT→CG,相应的氨基酸由谷氨酸(E58)突变为丙氨酸(A58),通过蛋白质数据库TS氨基酸同源保守序列的比对,以及E58在ThyA蛋白三维结构中的位置[10],了解E58为高度保守位点,在酶反应过程中直接或者间接地参与催化反应。运用Discovery studio分子模拟软件,比对TS变异前后蛋白三维结构,发现变异蛋白的E58附近的氨基酸位置有移位现象,其中F176的侧链苯环结构向活性空穴空间突出明显。E58的变异与F176的空间移位均导致酶催化活性的丧失。为进一步研究T营养缺陷型菌株中核苷酸代谢及相关应用奠定了基础。

[1] Stacey K A,Simson Eva.Improved method for the isolation of thymine-requiring mutants ofEscherichiacoli[J].Bacteriology,1965,90(2):554-555.

[2] Bertino J B,Stacey K A.A suggested mechanism for the selective procedure for isolating thymine-requiring mutants ofEscherichiacoli[J].Biochemistry,1966,101(2):32-33.

[3] Womack John E.Inhibition of thymidine phosphorylaseinvivoprovides a rapid method for switching DNA labeling[J].Molec Gen Genet,1977,158(1):11-15.

[4] 谢传晓,姚建铭,潘仁瑞,等.大肠杆菌离子束诱变及rpoB 基因两个新的利福平抗性位点鉴定[J].微生物学报,2003,43(6):732-739.

[5] Taylor G R,Barclay B J,Storms R K,et al.Isolation of the thymidylate synthetase gene (TMP1) by complementation inSaccharomycescerevisiae[J].Molecular and Cellular Biology,1982,2(4):437-442.

[6] 宋道军,余汛,余增亮.低能离子束对微生物细胞的直接作用和间接作用研究[J].高技术通讯,1999,9(1):47-50.

[7] Graziani S,Bernauer J,Skouloubris S,et al.Catalytic mechani- sm and structure of viral flavin-dependent thymidylate synthaseThyX[J].The Journal of Biological Chemistry,2006,281(33):24048-24057.

[8] 萨姆布鲁克·J,弗里奇·E·F,曼尼阿蒂斯·T.分子克隆实验指南(第二版)[M].北京:科学出版社,1992:955-956.

[9] Okada Toshihiko,Yanagisawa Keiko,Ryan F J.A method for securing thymineless mutants from strains ofE.coli[J].Molecular and General Genetics MGG,1961,92(4):403-412.

[10] Jarmula Adam,Cieplak Piotr,Montfort William R.5,10-Methylene-5,6,7,8-tetrahydrofolate conformational transitions upon binding to thymidylate synthase: Molecular mechanics and continuum solvent studies[J].Computer Aided Molecular Design,2005,19(2):123-136.

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