N+离子注入诱变筛选胸腺嘧啶缺陷型大肠杆菌

昌国强，欧 伶，丁庆豹，郑之明，王 丽，袁成凌

(1.华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2.中国科学院等离子体物理研究所 离子束生物工程学重点实验室，安徽 合肥 230031)

营养缺陷型菌株在工业微生物的设计育种、遗传学及医学等领域有着重要作用[1]。不同的研究及实际应用常常需要获得某种特定营养缺陷型的突变株，然而特定营养缺陷型菌株的筛选十分困难，需要经过复杂的物理和化学诱变才能获得。

离子束注入技术是20世纪80 年代中期研究出来的一种诱变技术[2]。与其它诱变源相比，离子束注入诱变可以在轻度损伤的情况下，获得更高的突变率(较其它诱变高出1～2个数量级)和更广的突变谱，因此被广泛运用于各种生物细胞诱变选育的研究。

大肠杆菌(Escherichiacoli)的胸苷酸(dTMP)代谢途径[3]有两条：第一条为从头合成途径，即尿苷酸(UMP)经过一系列的代谢途径，最后形成脱氧尿苷单磷酸(dUMP)，在胸苷酸合成酶(TS)的作用下生成脱氧胸苷单磷酸；另一条为补救途径，可以直接从体外吸收胸腺嘧啶或者胸腺嘧啶核苷来合成胸苷酸。

作者在此采用低能离子束注入法诱变大肠杆菌，并利用甲氧苄啶(TMP)[4]定向筛选，获得胸腺嘧啶(T)营养缺陷型的大肠杆菌突变菌株，再克隆出T营养缺陷型菌株TS基因[5]，通过基因重组技术构建T-重组子，并测定其TS基因序列，与正常大肠杆菌的TS基因进行对比，以鉴定突变株TS基因是否发生突变。

1 实验

1.1 菌种、质粒和培养基

E.coliDH5α，自行保存。

pMD-18T 载体，TAKARA生物技术公司；E.coliBL21(DE3)，Novagen。

LB液体培养基：蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，根据需要另加入终浓度100 μg· mL-1羧苄青霉素钠或50 μg· mL-1卡那霉素，固体培养时另加入17 g·L-1琼脂。

GS培养基：(NH4)2HPO42.5 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，MgSO4·7H2O (20%溶液)0.5 mL·L-1，谷氨酸钠 3.0 g·L-1，葡萄糖3.0 g·L-1。

GST培养基：(NH4)2HPO42.5 g·L-1，KH2PO41.5 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，MgSO4·7H2O (20%溶液)0.5 mL·L-1，谷氨酸钠 3.0 g·L-1，葡萄糖 3.0 g·L-1，胸腺嘧啶50 μg·mL-1。

1.2 试剂与仪器

DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶、T4连接酶，TAKARA生物技术公司；DNA回收试剂盒，天根生物技术公司；琼脂糖、标准分子量DNA (DNA Marker)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)，鼎国生物技术有限公司；低分子量标准蛋白(Protein marker)，中国科学院上海生化所；胰蛋白胨、酵母粉。其它试剂均为国产分析纯。

Mini MJ型PCR仪，DYCP-31型水平电泳槽，725型紫外光栅分光光度计，DY CZ-24 D型电泳仪，GL-312型UV检测仪，JY92-Ⅱ型超声破碎仪，低能离子注入仪(中国科学院等离子体物理研究所)。

1.3 菌株的诱变

1.3.1 菌悬液的制备

将大肠杆菌BL21于LB 液体培养基中培养至对数期，浓度约为1×108cfu·mL-1。取10 mL发酵液离心得菌体，用0.01 mol·L-1的磷酸缓冲溶液(PBS)重悬。取0.1 mL 重悬菌液均匀涂布于无菌空白培养皿中，无菌风吹干或自然晾干后立即进行N+离子注入。

1.3.2 N+离子注入[6]

将上述涂菌培养皿放入离子束注入靶室进行离子注入，注入能量为10 keV，靶室真空度为0.001 Pa，以8 s脉冲式注入，间隔为5 s，单次注入剂量为2.5×1013ions·cm-2。注入剂量(×2.5×1013ions·cm-2)分别为5、10、15、20、25、30、40、60、100。注入后立即用无菌缓冲溶液将培养皿上菌体冲洗下来。

以经过真空处理而不注入离子束的菌株作为对照。

1.3.3 诱变后处理

将经离子束注入过的样品培养皿在无菌条件下用无菌PBS洗脱，收集洗脱液，经适当稀释后涂布于含胸腺嘧啶的LB培养皿，置于培养箱中于37℃培养48 h后计数，计算存活率。

1.4 菌株的筛选

1.4.1 T营养缺陷型菌株的浓缩

将经离子束注入后的培养皿用PBS洗脱，取一定体积洗脱液，接种于含T的GS 液体培养基培养一段时间，再加入一定浓度的甲氧苄啶(TMP)，培养过夜，菌液离心后用PBS重悬。

1.4.2 T营养缺陷型菌株的筛选

取200 μL重悬菌液涂布于LB+T的培养皿上作为母板，置于培养箱中于37℃培养24 h，用平板影印法将母板上单菌落分别影印到GS+T+TMP培养皿及GS+TMP对照培养皿上，37℃培养24 h，将在GS+TMP培养皿上不生长、而在GS+T+TMP培养皿上生长的单菌落挑出，即为T营养缺陷型菌株。将筛选出来的T营养缺陷型菌株保存在终浓度15%的甘油储存液中并置于-80℃冰箱中保存备用。

1.4.3 T营养缺陷型菌株的鉴定

为了进一步研究T营养缺陷型菌株的生理特性，掌握营养缺陷的代谢机理，推测作为胸苷酸途径代谢的限速酶——胸苷酸合成酶基因发生突变，导致该酶失活，这可能是营养缺陷的原因。因此对该酶基因进行遗传学鉴定。

胸苷酸合成酶基因(ThyA)序列参见Genbank[7]。按文献[8]方法提取突变菌基因组，以其作为模板设计5′端引物 GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGA-AACAGTATTTAG、3′端引物 GGAATTCTTAGATAGCCACCGGCGCTTTAATG，进行PCR扩增，下划线处分别为XbaⅠ和EcoRⅠ的酶切位点。扩增条件为：95℃预变性5 min后，PCR循环：94℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物的纯化按琼脂糖凝胶回收试剂盒说明进行。

将回收的目的基因与pMD-18T克隆载体连接，转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布于含羧苄青霉素钠的LB平板上，过夜培养。挑单克隆菌株TPMD 1，提取质粒，进行限制性内切酶分析鉴定，如确定为阳性，进一步测定DNA序列。

1.4.4 DNA测序及序列分析

DNA测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成，双向测序，确保测序的准确性。序列分析由美国国立生物技术信息中心相应站点http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi在线完成，通过在线运行blastn和blastx，比对突变基因及其相对应的多肽序列，了解基因突变位点，并运用Discovery studio分子模拟软件考察TS蛋白在突变前后的三维结构变化，研究其TS变异后失活原因。

2 结果与讨论

2.1 N+离子注入对菌株存活率的影响(图1)

图1 N+离子注入对菌株存活率的影响

由图1可知，在N+注入剂量小于15×2.5×1013ions·cm-2时，随N+注入剂量的增加，菌株存活率迅速降低；当剂量达到15×2.5×1013ions·cm-2后，存活率有短暂的回升，后又逐渐下降，整个过程呈“马鞍型”变化曲线，注入剂量超过100×2.5×1013ions·cm-2后存活率趋于零。这可能是由于离子注入细胞的射程较短，离子束侵蚀细菌细胞表面，大量自由基在胞内堆积，破坏胞内活性大分子，使得细菌迅速死亡；但是当剂量增加到一定强度时，进入细菌体内的离子会在菌体外形成一种库仑斥力，在胞外形成保护屏障，阻碍离子靠近菌体细胞，细菌存活率开始上升；但是剂量超过一定限度，细胞又会失去保护屏障，开始慢慢死亡。因此，选择“鞍峰”位置剂量能获得最大突变率。本实验选择最佳诱变注入剂量为20×2.5×1013ions·cm-2，此时，菌株的存活率约为25%。

2.2 甲氧苄啶对突变菌筛选的影响

在筛选过程中为提高突变菌比例，需对诱变后的培养液进行适当浓缩处理。目前常用的细菌浓缩法为青霉素浓缩法[9]，但该方法不能定向选育，不方便后续的筛选工作。

本实验选用针对性更强的甲氧苄啶(TMP)作为筛选试剂。四氢叶酸是胸苷酸合成酶催化dUMP生成dTMP的供甲基体，四氢叶酸的供应不足，胸苷酸合成酶就无法发挥其催化作用，胸苷酸的正常代谢途径中断，菌体无法自身合成胸苷酸，在无外源胸腺嘧啶时可导致细菌死亡。TMP的作用是能与二氢叶酸还原酶发生不可逆结合，阻止体内四氢叶酸的生成，胸苷酸正常代谢途径受TMP的抑制作用，细菌无法正常生长。而T营养缺陷型菌株则不受TMP的影响，当培养基中添加了T或者胸腺嘧啶核苷(TR)时，能摄取T或TR来合成胸苷酸，满足T营养缺陷型菌株正常的生长需求。因此，T营养缺陷型菌株在含甲氧苄啶的GST培养基中能正常生长，而野生型菌株将会受到抑制。

通过测定T营养缺陷型突变菌株在有无TMP时光密度(有TMP时为OD600′，无TMP时为OD600)的比值(OD600′/OD600)，考察TMP浓度对菌株生长的影响，结果见图2。

图2 TMP浓度对突变菌生长的影响

OD600′/OD600太大，说明TMP没有起到筛选的作用；OD600′/OD600太小，说明TMP在抑制原始菌株生长的同时，也一并抑制了突变菌株。从图2可知，OD600′/OD600为0.3左右所对应的TMP浓度较佳，约为50 μg·mL-1。

2.3 PCR扩增产物及重组菌ThyA基因的检测(图3)

图3 PCR(a)及pMD-18T-ThyA(b)双酶切鉴定结果

由图3可知，突变菌与原始菌ThyA基因的PCR扩增后，回收产物琼脂糖凝胶电泳，目的基因大小为795 bp；重组克隆载体pMD-18T-ThyA双酶切后琼脂糖电泳，在800 bp和2500 bp附近都有条带出现，说明克隆质粒构建成功。

2.4 突变基因的测序及其突变位点的定位

分别测定原始菌株和突变菌株目的基因，并将测序结果与Genbank基因库的E.coliTS基因序列比对，鉴定出突变位点为第173个碱基由AT→CG，对应的氨基酸由谷氨酸(E58)突变为丙氨酸(A58)。谷氨酸为极性氨基酸，并且在同源性基因比对中发现该位点为高度保守位点，如图4所示。

图4 TS保守区域比对图

图4为TS氨基酸同源保守序列比对图，来源于NCBI蛋白质数据库；此图黑体字符为TS保守区域，带#号标记的氨基酸位点为TS氨基酸序列高度保守位点。在第二个#处为E.coliTS酶蛋白第58个氨基酸位点——酸性氨基酸谷氨酸(E58)，为酶活性位点区域，在酶催化过程中提供一个良好的催化环境，并传递质子，发挥着重要作用；E58突变为A58后，酶活性局部区域的极性环境发生巨大改变，催化反应中的质子化与去质子化无法顺利进行，酶活性下降。

在软件分析过程中还发现，E58突变为A58后，E58附近的另一氨基酸活性位点苯丙氨酸(F176)的空间位置发生了变化，如图5所示。

Glu58与Phe176突变前用标记，突变后用标记

由图5可知，F176的侧链苯环基团在TS变异后明显朝着空间位置突起，占据了酶活性部位的空间，直接导致酶催化反应底物在活性区域中无法处于正确的位置，甚至阻止了底物进入到活性部位。这样TS酶活性进一步降低，甚至失去活性。

3 结论

采用低能N+离子注入诱导大肠杆菌，通过TMP定向筛选得到T营养缺陷型菌株。应用遗传学方法，鉴定出ThyA基因确实发生突变，突变位点为第173位碱基由AT→CG，相应的氨基酸由谷氨酸(E58)突变为丙氨酸(A58)，通过蛋白质数据库TS氨基酸同源保守序列的比对，以及E58在ThyA蛋白三维结构中的位置[10]，了解E58为高度保守位点，在酶反应过程中直接或者间接地参与催化反应。运用Discovery studio分子模拟软件，比对TS变异前后蛋白三维结构，发现变异蛋白的E58附近的氨基酸位置有移位现象，其中F176的侧链苯环结构向活性空穴空间突出明显。E58的变异与F176的空间移位均导致酶催化活性的丧失。为进一步研究T营养缺陷型菌株中核苷酸代谢及相关应用奠定了基础。

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