侧脑室注射八肽胆囊收缩素及其受体拮抗剂对吗啡依赖大鼠戒断症状的影响

文 迪，马春玲，丛 斌，张雅静，2，杨胜昌，孟雁欣，于 峰，倪志宇，李淑瑾

(1.河北医科大学基础医学院法医学系，河北省法医学重点实验室，河北石家庄 050017;2.石家庄市第一医院，河北石家庄 050011)

长期反复使用外源性阿片类药物，打破了内源性阿片肽系统的平衡，复杂的神经、内分泌网络变化过程中存在多种生物活性物质的分泌和变化，以适应进入体内的大量阿片类物质;一旦停止用药，可引起机体机能功能紊乱，出现一系列的戒断症状。八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)是迄今体内最强的抗阿片肽类物质［1］，参与调节疼痛、焦虑情绪、记忆和认知等过程［2］。外源性和内源性阿片物质均可促进中枢CCK基因的表达和生物合成以及CCK-8的释放;我室以往的研究发现，吗啡可使大鼠原代培养海马神经元上CCK1及CCK2受体 mRNA表达上调，并以 CCK2受体为主［3－4］，说明CCK在阿片成瘾过程中也发挥着重要作用。本研究旨在观察CCK-8及CCK受体拮抗剂对吗啡依赖大鼠戒断症状的影响，并检测CCK-8对大鼠脑组织 μ阿片受体结合活性的影响，探讨CCK-8在吗啡依赖过程中的作用及其相关受体机制，为CCK-8在戒毒方面的应用提供相关实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 成年♂Wistar大鼠60只，体质量(200±10)g，由河北省实验动物中心提供(实验动物质量合格证:901014)。盐酸吗啡(沈阳第一制药厂);盐酸纳洛酮、CCK-8、DAMGO(美国 Sigma公司);devazepide、LY-288，513(英国 Tocris公司);［3H］-DAMGO(放射比活度 2.1 × 1015Bq·mol－1，浓度3.7 ×1010Bq·L－1，美国 PE 公司)，GF-B 型玻璃纤维滤膜(英国Whatman公司)。Angel Two脑立体定位仪(美国MyNeurolab公司);微量注射泵(美国KdScientific公司);微量注射套管(深圳瑞沃德生命科技有限公司);LS-6500型液体闪烁计数仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.2 动物模型的建立及分组 参照文献［5］建立大鼠慢性吗啡依赖及急性催促戒断模型:以剂量递增法连续皮下注射吗啡(10、20、30、40、50 mg·kg－1)5 d，每天2 次，间隔12 h(8:00、20:00)。d 6 8:00 皮下注射吗啡50 mg·kg－1，2 h后腹腔注射盐酸纳络酮(5 mg·kg－1)进行催促戒断，记录戒断后大鼠躯体戒断症状，包括戒断后15 min内跳跃次数、齿颤、湿狗样抖动、腹泻、血泪、流涎、激惹及1 h后体重变化，用改良 Gellert-Holtzman法［6］进行戒断症状的评价，具体评价方法见Tab 1。大鼠随机分组如下:①盐水对照组(Control):背部皮下注射同等剂量的生理盐水;②吗啡依赖组(Mor):按照上述方案进行吗啡皮下注射;③纳洛酮催促戒断组(Mor-Nal):按照上述方案给予吗啡皮下注射后2 h进行纳洛酮催促戒断;④慢性药物干预组(CCK-8，Dev，LY-288，513-Mor-Nal):给予吗啡前 10 min侧脑室注射 CCK-8(0.1 μg)，devazepide(1 μg)，LY-288，513(1 μg)，余同③;⑤溶剂对照组(Veh-Mor-Nal):给予吗啡前10 min，注射同等体积的溶剂(DMSO∶1，3-丙二醇=1∶4，2 μl)，余同③。

Tab 1 Gellert-Holtzman scale

1.3 大鼠脑立体定位及脑室注射 戊巴比妥钠40 mg·kg－1腹腔注射麻醉大鼠，取颅骨正中切口，10%H2O2进行烧灼，充分暴露颅骨表面前囟、人字缝等表面标志。核团定位以前囟为参照零点，用牙科钻打孔后通过立体定位仪的操作杆将微量注射套管 (外径0.6 mm，内径0.4 mm)插入脑内(AP，－1.67;ML，±0.92;DV，－3.10)用于脑室内给药，并用502胶及牙科水泥将微量注射套管固定于颅骨表面，术后预防性给予抗生素3 d。注射时将套管针芯拔出，插入内注射管，连接PE管和微量注射器进行注射。术后大鼠单笼饲养7 d后开始实验，侧脑室注射体积 2 μl，注射速度 0.5 μl·min－1，注射完后留针 5 min。实验完毕后通过套管注射 2 μl 0.1%台盼蓝，取脑观察脑室是否蓝染，剔除定位不准确的动物，最后保证每组6只动物。

1.4 大鼠脑组织膜受体蛋白的制备 大鼠断头取脑，加入10倍体积预冷的组织裂解液(50 mmol·L－1Tris-Cl pH 7.4，0.32 mol·L－1蔗糖，5 mg·L－1Aprotinin，5 mg· L－1Leupeptin，1 mmol· L－1PMSF，5 mmol·L－1EDTA)，冰浴下高速匀浆 1 min。冰浴孵育30 min，并用1 ml注射器反复抽吸5～6次，使其充分裂解。低速离心 10 min(4℃，1 000×g)，取上清超速离心20 min(4℃，20 000×g)，沉淀用 Tris-Cl缓冲液(50 mmol·L－1，pH 7.4)充分悬浮后，再次超速离心20 min(4℃，20 000×g)后将沉淀悬浮备用。考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(微板法)测定蛋白浓度后，用Tris-Cl缓冲液调整浓度至 1 g·L－1。

1.5 放射配基结合反应 总结合管中加入100 μl Tris-Cl缓冲液、100 μl膜蛋白制备液、100 μl［3H］－DAMGO(0.5 ～8 nmol·L－1);非特异结合管中加入 50 μl Tris-Cl缓冲液、100 μl膜蛋白制备液、50 μl DAMGO(5 μmol·L－1)、100 μl［3H］-DAMGO，总体积为300 μl，均做3个平行复管。充分混匀后4℃孵育过夜，次日在冰水浴中静置3 min终止反应，迅速通过玻璃纤维滤膜负压抽滤，分离未结合的标记配基，并用4 ml预冷的Tris-Cl缓冲液冲洗滤膜。取出滤膜经80℃ 40 min烤干，置于装有2 ml闪烁液(PPO 0.3 g，POPOP 3 g，二甲苯1 L)的 EP管中静置过夜，将 EP管放入闪烁杯中用 Beckman LS-6500型液体闪烁计数仪测量放射性活度(count perminute，CPM)。特异结合(specific binding，SB)为总结合(total binding，TB)与非特异结合(non-specific binding，NSB)之差。

1.6 统计学处理 ［3H］-DAMGO与μ阿片受体结合的平衡解离常数(Kd)和最大结合容量(Bmax)由GraphPad software进行分析，用Scatchard作图法经直线回归方程求得。所得数据用SPSS11.0进行统计学分析，以±s表示，各组均数的比较行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用最小显著差法(LSD)作两两比较。戒断症状评价中观察症状(Checked signs)以组内出现症状动物的百分数表示，组间差异采用Exact Logistic回归模型进行比较。

2 结果

2.1 CCK-8及其受体拮抗剂对吗啡成瘾大鼠戒断症状的影响 吗啡依赖大鼠在给予纳络酮催促戒断后，观察到齿颤、湿狗样抖动、腹泻、血泪、流涎、激惹、跳跃、体重明显下降等戒断症状，戒断组Gellert-Holtzman评分为(37.6±4.1)，与对照组(3.9 ±0.6)相比差异有显著性(P＜0.01)。在吗啡注射前10 min侧脑室注射CCK1受体拮抗剂Devazepide和CCK2受体拮抗剂LY-288，513慢性干预均能降低吗啡成瘾大鼠的戒断症状评分，其Gellert-Holtzman评分分别为(26.2±3.3)、(14.8±2.7)，与戒断组相比差异均有显著性(P＜0.01)，且 LY-288，513的作用优于Devazepide(P＜0.01);给予外源性 CCK-8(CCK受体激动剂)慢性干预同样可减轻吗啡依赖大鼠的戒断症状，其评分为(15.6±0.7)，与 CCK受体拮抗剂的作用一致(Fig 1)。CCK-8及其受体拮抗剂均可不同程度地改善体重下降(Fig 2)、跳跃、齿颤、流涎等戒断症状(Tab 2)。

Tab 2 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on checked signs of morphine withdrawal(±s，n=6)

Tab 2 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on checked signs of morphine withdrawal(±s，n=6)

Each of the listed signs was checked if present at any point during the 15 min observation session.The data was then converted to the percentage of rats in a particular experimental group which displayed that sign during the observation period.▲P ＜0.05 vs control;*P ＜0.05 vs Mor-Nal group.

Withdrawal Sign Control Mor Mor-NalCCK-8 Dev LY-288，513 Veh Diarrhea 0 0 1.0▲0.67 0.33 1.0 0.67 0.83 0.67 1.0 Teeth chattering 0 0 1.0▲ 0.67 0.63 0.33* 0.83 Ptosis 0 0 0.83▲ 0.33 0.67 0.17* 1.0 Chromodacryorrhea 0 0 0.67▲ 0.17 0.33 0.33 0.83 Abnormal posture0.17 0.17 1.0▲ 0.67 0.67 0.67 1.0 Genital grooming 0 0 0.83▲ 0* 0.33 0.17* 0.83 Irritability 0 0.17 1.0▲ 0.33*

Fig 1 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on the Gellert-Holtzman score of the overall withdrawal severity(±s，n=6)

2.2 CCK-8对大鼠脑组织μ阿片受体结合反应的影响 选取膜蛋白100 μg、［3H］-DAMGO 2 nmol·L－1、非标记配基 DAMGO 浓度 10 nmol·L－1作为结合反应的条件，在反应体系内加入不同浓度(10－8～10－5mol·L－1)的CCK-8进行竞争结合抑制实验，发现10－8～10－5mol·L－1CCK-8 可以剂量依赖性地抑制大鼠脑组织中μ阿片受体与配基的结合(P＜0.01，Fig 3)，并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受体拮抗剂翻转(P＜0.01，Fig 4);我们进一步用膜蛋白 100 μg、［3H］-DAMGO 0.5 ～8 nmol·L－15 个浓度点、非标记配基 DAMGO浓度10 nmol·L－1、4℃孵育过夜作为放射配基结合分析的条件(Fig 5)，测定了不同浓度的 CCK-8(10－10～ 10－6mol·L－1)对大鼠脑组织μ阿片受体的结合反应的Bmax和Kd值的影响，发现 CCK-8(10－8～10－6mol·L－1)可剂量依赖性的降低 μ阿片受体结合反应的Bmax值(P ＜0.01，Fig 6)，而对 Kd值无影响(P ＞0.05，Fig 7)。

Fig 2 Effects of CCK-8，devazepide and LY-288，513 on the percentage of the weight loss(±s，n=6)

Fig 3 Effect of 10-8～10-5mol·L-1CCK-8 on binding of［3H］-DAMGO to μ-opioid receptor(±s，n=3)

Fig 4 Inhibitory effect of CCK-8(10-6mol·L-1)on binding of［3H］-DAMGO to μ-opioid receptor is blocked by CCK1 receptor antagonist devazepide and CCK2 receptor antagonist LY-288，513(±s，n=3)

Fig 5 Effect of CCK-8(10-6mol·L-1)on saturation curve of μopioid receptor binding assay.

Fig 6 Effect of 10-10 ～ 10-6mol·L-1CCK-8 on Bmaxof μ-opioid receptor(±s，n=3)

Fig 7 Effect of 10-10 ～ 10-6mol·L-1CCK-8 on Kdof μ-opioid receptor(±s，n=3)

3 讨论

CCK-8是目前已知作用最强的内源性“抗阿片肽”，并作为一种神经递质/调制在中枢系统发挥着重要作用。本室以往研究发现给予吗啡前外周腹腔注射CCK-8及CCK受体拮抗剂均可减轻慢性吗啡依赖大鼠的戒断症状，并可通过调节阿片受体［7］及其受体后Ca2+-CaM-CaMKⅡ信号通路发挥作用［8］，但是由于CCK-8不能通过血脑屏障，其外周和中枢机制可能并不一致，CCK-8的相关作用机制也不明确，所以本研究通过侧脑室中枢给药的方式进一步观察了CCK-8及CCK受体拮抗剂对慢性吗啡依赖大鼠的影响;并采用放射配基结合实验，在体外观察CCK-8对μ阿片受体结合反应的影响。结果显示，每次注射吗啡前10 min侧脑室给予CCK-8及CCK受体拮抗剂进行慢性干预，均可不同程度的减轻慢性吗啡依赖大鼠的戒断症状，可明显缓解体重下降、腹泻、跳跃、齿颤、流涎等症状。阿片受体是外源性阿片类物质直接作用的靶点，在阿片类物质滥用后造成一系列后效应，使机体多个系统发生功能紊乱。放射配基结合实验结果显示，CCK-8可以抑制μ阿片受体与其配基的结合，并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受体拮抗剂翻转;CCK-8剂量依赖性的降低了μ阿片受体结合反应的Bmax值(受体结合容量)，而对 Kd值(受体亲和力)无影响;说明CCK-8并非直接影响 μ阿片受体的结合，而是与CCK受体结合后，继而与 μ阿片受体形成复合体，占据μ阿片受体的结合位点，降低受体结合容量，发挥其“抗阿片”效应，CCK系统与阿片系统可通过受体水平的对话(cross talk)发生相互作用。

内源性CCK对抗阿片物质的作用可能是导致阿片类物质耐受和成瘾的机制之一，CCK可从受体及受体后水平拮抗阿片系统的功能，还可调节多巴胺能神经元的活动，并参与多巴胺调节的可卡因自身给药模型、吗啡条件位置性偏爱的表达、焦虑情绪等过程［11－12］，在成瘾药物引起的奖赏效应中具有重要作用。因此，应用CCK受体拮抗剂能逆转吗啡耐受［9］、减轻吗啡催促戒断症状［10］。CCK-8 与 CCK1及CCK2受体均有较强的亲和力，本研究发现外源性CCK-8慢性干预也可一定程度的减轻戒断症状，与CCK受体拮抗剂的作用一致。我们考虑:CCK-8作用的量效关系成“U”型曲线，所以外源性大剂量CCK-8与内源性CCK的作用可能相反;我们也证实了大剂量CCK-8本身反而使内源性阿片肽水平增加，并可改善吗啡依赖后内源性阿片系统的紊乱［13］。另外，外源性CCK干预与内源性 CCK的分泌时相不一致，所以不同的给药方式及时间也可能造成实验结果的差异，注射吗啡前给予CCK-8干预，可能拮抗了吗啡的作用，发挥其“抗阿片”作用，进而影响外源性阿片物质引起的脑功能紊乱，减轻戒断症状。但是，阿片成瘾涉及受体、神经递质、细胞分子水平的调节等环节，是一种复杂的脑功能紊乱;在阿片成瘾的不同过程中，其神经机制并不一致，CCK-8在成瘾各个环节的作用可能并不相同，在不同的实验研究模型中也表现出不同的结果，外源性CCK-8对吗啡成瘾不同阶段的作用及其相关机制还有待进一步明确。

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