环孢霉素A联合干扰素-α对膀胱癌T24/ADM耐药逆转的研究

郭 祥，刘红耀，王靖宇

山西医科大学附属第一医院，山西太原 030001

膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，目前膀胱肿瘤的治疗手段仍以手术、化疗、放疗及免疫辅助治疗为主。膀胱肿瘤有较高的复发率（40%～80%），除了膀胱肿瘤本身特有的生物学特性外，膀胱肿瘤多药耐药（multidrug resistance，MDR）的产生，是膀胱癌临床化疗失败的主要原因之一[1]。MDR成因很多，其中与P糖蛋白（P-gp）、谷胱甘肽S转移酶（GST）和拓扑异构酶（TOPO）的异常表达有关[2]。怎样逆转MDR成为治疗肿瘤的难点和热点。笔者选用以建立耐阿霉素（ADM）的耐药株，运用不同浓度下的环孢霉素A（CsA）及干扰素-α（INF-α），单独及联合两种药物与ADM共同作用，来探讨其逆转效果。现将结果报道于下：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 INF-α （深圳万乐公司），CsA （上海天丰药厂），MTT（噻唑蓝，美国 SIGMA 公司产品），ADM（天津金耀氨基酸有限公司）。

1.1.2 细胞来源 膀胱癌T24/ADM耐药株由山西医科大学附属第一医院泌尿外科刘红耀教授惠赠。

1.2 方法

将实验分成四组实验组，取对数生长期的T24/ADM细胞，以5×105/ml接种于96孔板中，在96孔板中每孔加入25 μl的细胞悬液，于37℃、5%CO2、95%的空气在培养箱中培养24 h，每组各孔均以25 μl加入1.0 mg/L浓度的ADM；第一组中加入不同浓度的 CsA：0.1、1.0、2.0、3.0 μg/ml； 第二组中加入不同浓度的 INF-α：2.0×106、4.0×106、10.0×106、20.0×106U/L；第三组加入 1.0 μg/ml的 CsA 与不同浓度的 INF-α（2.0×106、4.0×106、10.0×106、20.0×106U/L）；第四组加入 2.0×106U/L 的INF-α 与不同浓度的 CsA（0.1、1.0、2.0、3.0 μg/ml）。 每组浓度组均设有3个复孔。最后将实验组和阴性孔（对照组）全部用含有10%胎牛血清的培养基调整至100 μl。于37℃、5%CO2条件下培养24 h。实验终止前6～8 h各孔加入0.5%MTT 50 μl，再培养6 h，显微镜下待细胞对照孔有明显颗粒结晶时，加入10%SDS-HCl 150 μl终止反应，并于 37℃下存放 12 h。在微孔振荡器下待颗粒溶解充分后，用酶联免疫检测仪于490 nm波长下测各孔OD值，分别计算细胞抑制率、半数抑制浓度（IC50）和耐药倍数（RI）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0对所得数据进行统计学分析，采用成组设计，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 环孢霉素A和干扰素-α分别对膀胱癌T24/ADM耐药性的影响

本研究结果表明，INF-α和CsA能不同程度地逆转膀胱癌T24/ADM的耐药性，且呈明显剂量效应反应关系。与对照组ADM单独作用相比，当实验组CsA浓度为0.1 μg/ml或INF-α浓度为2.0×106U/L时，两者虽然也能部分提高细胞抑制率，但差异无统计学意义（P＞0.05）；当 CsA 浓度≥1.0 μg/ml或INF-α浓度≥4.0×106U/L时，就能明显提高细胞抑制率，差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表 1、2。

表1 不同浓度的环孢霉素A对膀胱癌T24/ADM耐药性的影响（）

表1 不同浓度的环孢霉素A对膀胱癌T24/ADM耐药性的影响（）

注：实验组及对照组ADM均为1.0 mg/L；“-”表示无数据

组别 CsA（μg/ml）00.11.02.03.0对照组第一组第二组第三组第四组生长抑制率（%）12.800±0.02514.700±0.02518.800±0.02525.000±0.02539.500±0.025 t值-P值-4.0206.1179.48021.843＞0.05＜0.05＜0.01＜0.01

表2 不同浓度的干扰素-α对膀胱癌T24/ADM耐药性的影响（）

表2 不同浓度的干扰素-α对膀胱癌T24/ADM耐药性的影响（）

注：实验组及对照组ADM均为1.0 mg/L；“-”表示无数据

组别 INF-α（U/L）02.0×106 4.0×106 10.0×106 20.0×106对照组第一组第二组第三组第四组生长抑制率（%）14.100±0.02821.900±0.02637.800±0.02547.400±0.02048.600±0.015 t值-P值-2.71010.00712.98028.883＞0.05＜0.05＜0.01＜0.01

2.2 环孢霉素A和干扰素-α联合对膀胱癌T24/ADM耐药性的影响

联合小浓度的INF-α和CsA与ADM共同作用，与单独运用INF-α、CsA逆转相比较，小浓度的INF-α和CsA联合就能取得满意的效果（P＜0.05）；当 CsA 浓度为 1.0 μg/ml与 INF-α浓度为4.0×106U/L联合作用时，就能超过CsA浓度为3.0 μg/ml单独作用及INF-α浓度为20.0×106U/L单独作用时的效果；当CsA 浓度为 0.1 μg/ml联合2.0×106U/L的 INF-α 时，就能达到CsA浓度为2.0 μg/ml单独作用时的效果。见表3、4。

3 讨论

T24/ADM细胞是对ADM耐药的人膀胱癌细胞株。该耐药细胞株具有MDR的特征。近年来的研究表明干扰素能够逆转MDR，其机制可能是[3]干扰素通过影响基因的表达，竞争性抑制P-gp和抗癌药物结合，使P-gp的药物泵功能下降，影响了肿瘤细胞的通透性，使细胞内的化疗药物浓度增加。还有研究表明[4]，干扰素与一些化疗药联合对肿瘤细胞的抑制具有协同作用，能增加肿瘤细胞内化疗药物的浓度，逆转肿瘤细胞的MDR，本实验结果与其相符。CsA对MDR逆转，其机制可能是[5]通过提高P2糖蛋白（P2gp）磷酸化水平，与P2gp非特异结合，拮抗P2gp对药物的结合和转运，或通过蛋白激酶C改变细胞内药物分布、结合，以及钙调蛋白改变离子通透性、降低细胞内谷胱甘肽水平等逆转耐药[6]。

表3 环孢霉素A与不同浓度干扰素-α联合对膀胱癌T24/ADM耐药性的影响（）

表3 环孢霉素A与不同浓度干扰素-α联合对膀胱癌T24/ADM耐药性的影响（）

注：实验组及对照组ADM均为1.0 mg/L，CsA浓度为1.0 μg/ml

组别 INF-α（U/L）02.0×106 4.0×106 10.0×106 20.0×106对照组第一组第二组第三组第四组生长抑制率（%）19.800±0.02644.700±0.01857.600±0.02572.600±0.01889.600±0.020 t值-P值-21.68020.16818.38619.168＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

表4 干扰素-α与不同浓度环孢霉素A联合对膀胱癌T24/ADM耐药性的影响（）

表4 干扰素-α与不同浓度环孢霉素A联合对膀胱癌T24/ADM耐药性的影响（）

注：实验组及对照组ADM均为1.0 mg/L，INF-α浓度为2.0×106U/L

组别 CsA（μg/ml）00.11.02.03.0对照组第一组第二组第三组第四组生长抑制率（%）21.100±0.02637.800±0.02844.900±0.02351.200±0.02758.200±0.024 t值-P值-15.62038.12039.86023.832＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

本研究中发现，随着CsA浓度的增加，ADM对膀胱癌肿瘤细胞毒性逐渐加强，对膀胱癌肿瘤细胞MDR的逆转作用与CsA的浓度呈明显剂量效应关系；联合INF-α与CsA逆转T24细胞MDR，结果表明当INF-α浓度为2.0×106U/L，CsA浓度为0.1 mg/ml时就与CsA浓度为3.0 mg/ml单独逆转的效果相当，而且随着CsA浓度的增加，协同作用明显增强（P＜0.01）。本实验表明虽然单独运用INF-α、CsA也能逆转肿瘤细胞MDR，但联合应用则作用明显，能减少这些药物单独运用时的剂量，加强了化疗药物的抗肿瘤作用，起到了“1+1＞2”的效果，为临床用药提供理论依据。

[1]Shen F,Chu S,Bence AK,et al.Quantitation of doxorubicin uptake,efflux,and modulation of multidrug resistance(MDR)in MDR human cancer cells[J].The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2008,324(1):95-101.

[2]Uno K,Suginoshita Y,Kakimi K,et al.Impairment of IFN-αproduction capacity in patientswith hepatitis C virus and the risk of the development of hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2005,11(46):7330-7334.

[3]Marotta G,Frassoldati A,Zinzani P,et al.Role of interferon alpha administration after 2-deoxycoformycin in the treatment of hairycell leukemia patients[J].Eur J Haematol,2006,77(2):109-113.

[4]Shapira Y,Arthur M,Calvin C,et al.Therapeutic time window and dose response of beneficial of ketamine inexperimental head injury[J].Stroke,1994,25(8):1637-1643.

[5]徐玉乔,惠延平,马世荣.环孢霉素A逆转人白血病耐药细胞系HL260/ADM及其超微弱发光的观察[J].现代生物医学进展,2007,7(5):663-666.

[6]熊茂明,区庆嘉,孟翔凌,等.环孢霉素A逆转肝癌多药耐药的实验研究[J].中华实验外科杂志,2004,21(5):544-546.